ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №11 (1 семестр) Тема Современные методы генетики и работа с базами данных генов. ПЦР. Таргетная терапия

ТЕМА ЗАНЯТИЯ: СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ГЕНЕТИКИ И РАБОТА С БАЗАМИ ДАННЫХ ГЕНОВ. ПЦР. ТАРГЕТНАЯ ТЕРАПИЯ.

Цель занятия:

Познакомиться с наиболее актуальными методами молекулярной генетики, лежащими в основе геномных технологий и ДНКдиагностики болезней человека.

Изучить базы данных генов.

Познакомиться с одним из направлений медикаментозного лечения рака - таргетной терапией.

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ

1.Виды современных молекулярно-генетических исследований. Их значение для медицины.

2.Рестрикция ДНК.

3. Секвенирование. Разнообразие SNP (снипы)

4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

5. Понятие таргетной терапии, как одного из видов молекулярной медицины.

6. Биоинформационные подходы в геномике. Геномные базы данных человека.

7.Базы данных для поиска геномных маркеров (GenBank National Center for Biotechnology Information; OMIM - On-line Mendelian Inheritance in Man и т.д.)

Задание № 1. Основные понятия.

Запишите и выучите основные понятия по теме.

1.Этапы проведения ПЦР

2.Рестрикция ДНК

3.Денатурацию ДНК

4.Элонгация ДНК

5.Амплификация ДНК

6.Ампликон

7.Электрофорез ДНК

8.Праймеры

1

9. Отжиг праймеров

10.Taq-полимераза

11.Рестриктазы

12.ДНК-зонды

13.Метод Real-time PCR

14. Метод In situ ПЦР

15.Секвенирование ДНК

16.SNP (снип)

17.Экспрессия гена

18.Генная сеть

19.Протоонкогены

В настоящее время молекулярно-генетические методы широко применяются для выявления вирусоносителей, определения генов тканевой совместимости при трансплантации, идентификации мутантных аллелей генов мультифакториальных болезней, геномной дактилоскопии и пренатальной диагностике.

Задание № 2. Рассмотрите рисунок 1 и изучите механизм действия рестриктаз на ДНК.

Рис.1. Схема рестрикции ДНК

2

Рис.2. Схемы проведения полимеразной цепной реакции. (wikimedia.org)

Задание № 4. Познакомьтесь со схемами детекции продуктов амплификации при электрофоретическим разделением ПЦР и методом Real-Time ПЦР (Рисунок 3,4).

Существует несколько видов детекции продукта ПЦР:

электрофоретическим разделением ПЦР-амплификационной смеси на окрашенном бромистым этидием агарозном или полиакриламидном геле и путем гибридизации со специфическим радиоактивным или флуоресцентным олигонуклеотидным зондом.

В практическое здравоохранение внедряется технология ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Метод real-time PCRне требует визуализации продуктов реакции с помощью гель-электрофореза — их накопление фиксируют в реальном времени оптические датчики, вмонтированные в амплификатор и настроенные на определенную длину волны, испускаемую флуоресцирующими метками (рис.3, рис.4).

4

Рис.3. Схема опыта по анализу фрагментов ДНК: М - маркер молекулярной массы фрагментов ДНК; 1 - нормальный образец ДНК;

2 - изучаемый мутантный образец ДНК

5

Рис.4. Учет и интерпретация результатов ПЦР исследования генетических полиморфизмов ассоциированных с риском развития

артериальной гипертензии в режиме Real-Time

Задание № 5. Ознакомьтесь с одним из направлений фармакотерапии в основе которого лежит молекулярный подход к индивидуализации противоопухолевого медикаментозного лечения.

Таргетная терапия (от английского слова target – «цель», «мишень»),

молекулярно-таргетная терапия – одно из основных направлений современной противоопухолевой терапии.

К середине 60-х годов прошлого века эффективность в лечении некоторых видов рака была достигнута путем комбинированного лечения сразу несколькими химиотерапевтическими препаратами. При использовании комбинированной химиотерапии заметили, что различные химиотерапевтические препараты более эффективны на различных этапах клеточного цикла. Стало очевидно, что развитие ракового перерождения в клетках как-то связано с прохождением определенных

6

этапов клеточного цикла. Мутации, инициирующие раковое перерождение,

напрямую или опосредовано, затрагивают процессы регуляции клеточного цикла.

Важнейшим направлением в развитии медицины на современном этапе является индивидуализация терапии опухолей, основанная на уточнении молекулярно-генетических особенностей новообразований. Таргетная терапия пока ещё находится на начальных этапах своего развития, однако есть все основания полагать, что молекулярные подходы к индивидуализации противоопухолевой терапии получат бурное развитие в самое ближайшее время. Данное направление позволяет выявлять маркеры, отвечающие за лекарственную чувствительность опухоли.

Механизмы действия противораковых таргетных препаратов в основном направлены на отключение молекул, являющихся частью молекулярных сигнальных путей и приводящих к запуску событий в ядре клетки, нарушающих механизмы контроля клеточного цикла.

При проведении данной терапии учитываются данные об экспрессии продуктов определенных генов, а также данные о наличии соматических мутаций этих генов. Кроме того, препараты могут быть направлены против патологических белковых комплексов, часто образующихся в опухолевых клетках с целью подавления роста, пролиферации и жизнеспособность опухолевых клеток за счет специфических взаимодействий с одним или несколькими белками-мишенями.

Благодаря этому методу повысилась выживаемость больных некоторыми формами рака молочной железы, меланомы.

Задание № 6. Познакомьтесь с работой в геномных базах данных человека.

1) Мутация гена NF1 у человека вызывает тяжелое генетическое заболевание, нейрофиброматоз первого типа (neurofibromatosis, type1).В какой хромосоме у человека локализован ген NF1?

Выполните задание с помощью базы данных: Online Mendelian Inheritance in Man

(OMIM).

Пример решение задачи:

1. Вход на сайт ncbi.nlm.nih.gov 2. в графе поиск с левой стороны найти

Genome __ Custom resources Human Genome___ Search for Human

7

Genes____ neurofibromatosis, type1__ там будет представленная вся имеющаяся информация об этом гене!!!

Расположение: 17q11.2. Количество экзонов: 58.

Задание № 7. Решите ситуационные задачи.

Задача № 1. Задача на установление отцовства при электрофоретическом

разделения продуктов ПЦР (рис.5.).

ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического материала с места преступления — кровь, слюна, сперма, волосы и т. п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически — одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью ДНК электрофореза. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев (англ.geneticfingerprint).

Рис.5. Результаты электрофореза ДНК-фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР. (1) Отец. (2) Ребенок. (3) Мать.

8

Дайте заключение об отцовстве в первом и во втором случае.

Обоснуйте ваше заключение.

Задача № 2. Выполните задание с помощью: Online Mendelian Inheritance

in Man (OMIM).

Семейный рак молочной железы и рак яичников (РМЖ) диагностируется чуть ли не у каждой 10-й женщины Европы. Приблизительно 5-10 % РМЖ являются наследственными. Картированы и идентифицированы два гена – онкосупрессора –BRCA –1 иBRCA– 2, мутации в которых и являются причиной семейных РМЖ и яичников. В какой хромосоме у человека локализован гены BRCA –1 иBRCA – 2?

Задача № 3. Проведение рестрикции ДНК.

Прочитайте внимательно задание и выполните его.

Молекула ДНК длиной 5000 пар нуклеотидов (п. н.). обработана отдельно рестриктазами А и В. Рестриктаза А разрезала ДНК на 4 фрагмента размером 2100, 1400, 1000 и 500 п. н. Рестриктаза В дала 3 фрагмента: 2500, 1300 и 1200 п. н. Обработка изучаемого фрагмента одновременно двумя рестриктазами дала 6 фрагментов: 1900, 1000, 800, 600, 500, 200 п. н.

Представлена карта рестрикции этого фрагмента ДНК. Используя данные рестрикции ферментов А и В смоделируйте рестрикционное картирование, сопоставляя на данную карту рестрикции фрагмента ДНК.

Основная литература

1.Биология : в 2-х т. – Т. 1 : учебник / В.Н. Ярыгин, В.В. Глинкина, И.Н. Волков [и др.]; под ред. В.Н. Ярыгина. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2011, 2015. - 725 с.

2.Пехов А.П. Биология. Медицинская биология, генетика и паpазитология : учебник / А.П. Пехов. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2011. - 656 c.

Дополнительная литература

9

1.Гигани О.Б. Биология: руководство к лабораторным занятиям : учебное пособие /

О.Б. Гигани. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2012. - 272 с.

2.Биология : руководство к практич. занятиям / В.В. Маркина, Ю.Д. Оборотистов,

Н.Г. Лисатова [и др.] / под ред. В.В. Маркиной. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2015. - 448 с.

3.Чебышев Н.В. Биология: учебное пособие / Н.В. Чебышев, Г.Г. Гринева. – М. :

ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 416 с.

10