ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДНК-ТЕХНОЛОГИЙ В МЕДИЦИНЕ - МЕТОДЫ ПЦР И СЕКВЕНИРОВАНИЯ. ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ
.pdfпервичного биохимического дефекта, исследование структуры, функции и внутриклеточного распределения его белкового продукта, а также биохимический анализ патологического процесса. План генотерапевтических вмешательств определяется также доступностью клеток-мишеней, периодом их жизни и характером миграции в организме, эффективностью и специфичностью трансфекции клеток и продолжительностью экспрессии введенного гена.
Наиболее перспективной представляется возможность генетической модификации не самих дифференцированных клеток с наследственным дефектом, а их предшественников - плюрипотентных стволовых клеток.
Определение типа клеток, подлежащих генетической модификации,
завершается оценкой результата переноса гена в системе in vitro и проведением экспериментов на животных моделях. Апробацию процедуры генокоррекции наследственного заболевания проводят на первичных культурах экспрессирующих клеток больного либо на перевиваемых культурах,
полученных после предварительной трансформации первичных культур. На этих клеточных моделях оценивают эффективность выбранной системы переноса экзогенной ДНК, определяют экспрессию вводимой генетической конструкции, анализируют ее взаимодействие с геномом клетки, отрабатывают способы идентификации первичного дефекта и его коррекции на биохимическом уровне.
Тем не менее, многие проблемы генной терапии не могут быть решены на клеточном уровне. Важное значение имеет анализ влияния введенных ДНК на межклеточные взаимодействия, определяющие работу соответствующих тканей
иорганов. Такие исследования могут быть проведены только in vivo.
3.2Методы генетической трансфекции в генной терапии
Решающим условием успешной генной терапии является обеспечение эффективной доставки, т.е. трансфекции (в широком смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векторов) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длительной персистенции его в этих клетках и
создание условий для полноценной экспрессии. Существуют следующие
основные подходы к трансфекции клеток:
1)трансфекция "чистой" ДНК, лигированной в соответствующую плазмиду;
2)трансфекция комплексированной ДНК, т.е. - плазмидной ДНК,
находящейся в комплексе с солями, белками (например, трансферрином),
органическими полимерами (ДЭАЭ-декстраном, полилизином), липосомами или частицами металлов (золото, вольфрам);
3) трансдукция ДНК в составе вирусных частиц, предварительно лишенных способности к репликации;
Условием длительной персистенции чужеродной ДНК в клетках-
реципиентах является ее встраивание в геном клетки-хозяина. Пребывание чужеродной ДНК в ядре клетки в свободном состоянии (в виде эписом)
неизбежно ведет к ее элиминации даже в неделящихся клетках и,
соответственно, к ее транзиторной (временной, обычно в течение нескольких месяцев) экспрессии. Необходимой предпосылкой экспрессии чужеродной ДНК является наличие соответствующих промоторов. В случае наличия тканеспецифических промоторов можно добиться экспрессии введенного гена только в определенных тканях и клетках. Методы доставки чужеродных генов в клетки подразделяются на физические, химические и биологические.
Реальная интеграция чужеродной ДНК в геном клетки-реципиента может быть достигнута только с использованием ретровирусных и аденоассоциированных векторов.
3.3 Коструирование векторных систем для трансфекции клеток человека
3.3.1 Основные векторные системы
Как правило, вводимый генетический материал представляет собой полноразмерную последовательность кДНК определенного гена,
инсертированную в экспрессионный вектор и находящуюся под контролем сильного промотора. Выбор подходящего промотора зависит от многих параметров, главным из которых является необходимый уровень экспрессии в
клетках-мишенях. Вектор часто содержит один из маркерных генов (neo, β-Gal,
ген люциферазы), присутствие которых в трансдуцированных клетках может быть легко обнаружено. Существует 2 типа векторных конструкций:
1)на основе плазмидной ДНК;
2)на основе вирусов;
Плазмидные конструкции удобны для клонирования, генно-инженерных манипуляций, а также получения большого количества рекомбинантной ДНК.
Однако, бактериальные плазмиды, в отличие от вирусных конструкций, не способны самостоятельно проникать в эукариотические клетки. Для введения инсертированной в плазмиду экзогенной ДНК в клетки человека необходимо перенести ее в подходящий вирусный вектор или применить способ,
облегчающий ее прохождение через клеточные мембраны.
3.3.2 Физико-химические методы переноса чужеродной ДНК в клетки эукариот
Чужеродная ДНК может спонтанно проникать в клетки эукариот благодаря наличию в плазматической мембране белков, специфически связывающих ДНК. Путем эндоцитоза чужеродная ДНК попадает в цитоплазму в составе эндосом и обычно быстро разрушается лизосомальными ферментами.
Только небольшая часть экзогенной ДНК выходит из экзосом, попадает в ядро и если не разрушается эндогенными нуклеазами, то может быть интегрирована в ДНК клетки. Такое, однако, случается достаточно редко. Исключение составляют скелетные мышцы, в которых благодаря низкой активности эндогенных нуклеаз и низкой пролиферативной активности введенная ДНК может долго (до 1 года) сохраняться и даже экспрессироваться.
Эффективная доставка чужеродной ДНК непосредственно в ядро клетки-
мишени может быть осуществлена путем микроиньекции, при помощи электропорации, а также посредством перфорации клеточных мембран золотыми или вольфрамовыми микрочастицами, коньюгированными с чужеродными ДНК и разогнанными до высокой скорости (метод бомбардировки). Эти методы доставки применимы главным образом для клеток, культивируемых in vitro. Исключение составляет лишь метод
бомбардировки с использованием специального "генного ружья", который успешно применяется in vivo.
Для повышения эффективности переноса обычно используют соединения или группы соединений, взаимодействующие с ДНК с образованием компактных структур, облегчающих проникновение ДНК в клетки и защищающих ее от действия нуклеаз. Примерами таких способов трансфекции являются система кальций-фосфорной коприципитации, а также рецептор-
опосредованный транспорт, предусматривающий создание трехкомпонентной конструкции: ДНК-поликатион + лиганд + вирус.
В качестве лигандов используются специфические белки, такие как трансферрин, эритропоэтин, асиалогликопротеин, коньюгированный с альбумином инсулин и некоторые другие, взаимодействующие с клеточными рецепторами и обеспечивающие фиксацию генной конструкции на специфических клетках (Рис. 36).
Рис. 36 Рецептор-опосредованный перенос гена
Лиганды ковалентно присоединяются к связывающим и компактизующим чужеродную ДНК катионным носителям (полилизин, ДЭАЭ-
декстран). Важным компонентом системы является аденовирус, выступающий в качестве эффективного фузогенного агента, обеспечивающего выход экзогенной ДНК из эндосом после попадания ее в цитоплазму клеток-мишеней.
Адресная доставка и защита от действия лизосомальных ферментов обеспечивают высокую трансфекционную способность таких конструкций.
Еще одной системой, основанной на сочетании физико-химического подхода и использования вирусов, является конструкция, основанная на использовании филаментного фага fd для трансфекции эпителиальных клеток.
Гены fd, кодирующие белки оболочки фага, экспрессируются на его
поверхности. В один из них инсертируют последовательность, кодирующую поли-L-лизин. Полилизиновые мотивы в составе химерного белка связываются с плазмидной ДНК и удерживают ее на поверхности фага. В другой ген оболочки фага инсертируют последовательность ДНК, кодирующую какой-
либо агент, специфически связывающийся с апикальной поверхностью эпителиальных клеток и интернализирующий конструкцию внутрь клетки. Для этой цели могут использоваться гены патогенных бактерий, поражающих кишечный эпителий, кодирующих белки интерналин и инвазин, а также последовательности ДНК, кодирующие пептидные фрагменты вариабельных доменов моноклональных антител.
Направленный перенос генов во многие типы клеток, содержащие трансферриновые рецепторы, может быть осуществлен при комплексировании ДНК с трансферрином. Использование в этом комплексе аденовирусного вектора существенно облегчает прохождение ДНК через эндосомы и попадание ее в ядро.
3.3.3 Липосомный метод трансфекции
Эффективный внутриклеточный транспорт и защита от деградации лизосомальными ферментами достигаются при использовании в качестве векторов липидных везикул (липосом), обладающих выраженными фузогенными свойствами. Особенно перспективны в этом отношении липосомы, полученные на основе катионных липидов, обеспечивающих 100%
связывание ДНК в конденсированные нуклеолипидные частицы.
Положительный заряд на поверхности таких везикул обеспечивает их эффективное слияние с отрицательно заряженными клеточными мембранами и прямое попадание чужеродной ДНК в цитоплазму, минуя эндосомы. Особенно эффективными являются комплексы, в которых липосомы коньюгируют с мембранными антителами к определенным белкам-мишеням
(иммунолипосомы) или с белками-лигандами. Эти конструкции обеспечивают эффективную адресную доставку чужеродной ДНК в клетки-мишени.
3.3.4 Рекомбинантные вирусы
Эволюционно сложившаяся система эффективного проникновения вирусов в клетки-мишени, а в случае ретровирусов и система интеграции в клеточный геном позволяет использовать вирусы, как естественные векторы чужеродной ДНК для клеток млекопитающих.
В качестве векторов чаще всего применяют следующие рекомбинантные вирусы:
1)ретровирусы
2)аденовирусы
3)аденоассоциированные вирусы
4)вирус гепреса (HSV)
5)вирус ВИЧ (HIV)
6)вирус ветряной оспы
Ретровирусные векторы представляют собой генные конструкции на основе ретровирусов (РНК-содержащих вирусов), особенно часто используемые для трансдукции ДНК ex vivo. Наиболее популярным ретровирусным вектором является вирус мышиного лейкоза Molony (MoMLV).
По сравнению с другими типами векторов ретровирусы обладают уникальной способностью эффективно переносить чужеродные гены и стабильно интегрировать их в геном делящихся соматических клеток. Для безопасности ретровирусные последовательности модифицируют таким образом, что в инфицированных ими клетках не производятся вирусные белки. Это достигается за счет удаления или инактивации всех кодирующих последовательностей вируса. Репликация вирусных векторов может происходить только в специальных "пакующих" клетках, в геном которых встроены все гены, кодирующие вирусные белки. При введении ретровирусных векторов в эти клетки образуются вирионы, несущие векторные РНК и способные лишь проникать в клетки-мишени, но не размножаться в них.
Недостатком данной системы, также как и других векторных систем на основе вирусов, является возможность контаминации производящей клеточной линии нормальным ретровирусом и получения на его основе компетентного по репликации вируса. Для предотвращения этого необходимо регулярное
тестирование "пакующей" линии клеток. К другим серьезным недостаткам
ретровирусных векторов относятся:
1)их способность трансдуцировать только пролиферирующие клетки;
2)способность индуцировать мутации при случайной интеграции в
геном;
3)возможность спонтанной активации онкогена;
4)небольшие размеры переносимой ДНК-вставки - до 8000 п.о.
5)сравнительно низкий титр (106 - 107 на 1 мл) рекомбинантных вирусных частиц, получаемых для трансдукции;
6)необходимость конструирования соответствующих "пакующих"
клонов клеток;
Аденовирусные векторы в отличие от ретровирусов активно инфицируют неделящиеся клетки, обладают большей потенциальной пакующей способностью (>8000 п.о.), имеют более высокий титр (1011 на 1 мл),
однако не обеспечивают встраивание чужеродной ДНК в геном клетки-хозяина.
Их использование перспективно для генокоррекции клеток верхних дыхательных путей, легких, мозга, печени, мышц, кожи и др. Данный тип векторов был использован в первых клинических испытаниях по генотерапии муковисцидоза, показавших их эффективность при доставке аэрозольным способом. В аденовирусные векторы также инсерцируют маркерные гены (neo, CAT, β-галактозидазный ген (β-Gal)) для последующей идентификации трансдуцированных клеток. Для конструирования векторов используют дефектные по репликации аденовирусы, которые получают путем вырезания из вирусной ДНК генов, кодирующих белки E1a, E1b, а также регуляторный белок
E4. Такая конструкция может поддерживаться только в присутствии клеток-
помошников (например, в культуре клеток почек человека). Удаление большого числа аденовирусных генов из векторов часто сопровождается их дестабилизацией, что является одним из главных их недостатков, так как в ряде случаев остающиеся гены, трансдуцированные в клетки-мишени способствуют формированию иммунного ответа.
Аденоассоциированные вирусы (AAV) обладают значительно меньшей пакующей способностью (~5000 п.о.). Однако, в отличие от ранее рассмотренных вирусов, они не обладают онкогенной активностью, не патогенны, способны интегрироваться в геном, где преобладают в латентном состоянии. Уникальной особенностью AAV является их способность к стабильной неслучайной интеграции в один из районов хромосомы 19.
Специфичность интеграции вируса определяется наличием в его геноме гена rep. близкородственные к AAV парвовирусы (H1, MVM, LuIII) обладают еще меньшей пакующей способностью (~2000 п.о.) и не обладают способностью к специфическому встраиванию. Однако, они также рассматриваются как потенциальные векторы.
Вирус простого герпеса (HSV) - это крупный (152 тыс. п.о.) ДНК-
содержащий вирус, не интегрирующийся в геном при трансформации и формирующий эписомные структуры в ядрах клеток. Уникальной особенностью HSV является его выраженная тропность к клеткам нервной ткани, в связи с чем представляется перспективным его использование для терапии опухолей ЦНС, а также болезни Паркинсона и других нейродегенеративных заболеваний. Преимуществом HSV как вектора для генной терапии состоит в его высокой пакующей способности (> 30 000 п.о.).
Важным этапом в создании векторов на основе HSV является удаление из его генома области ICP22, ответственной за синтез литических белков, и индукция мутации 1814, вызывающей блок транскрипции вирусной ДНК. В последнее время на основе HSV стали получать искусственные производные вируса, так называемые "ампликон-продукты", лишенные практически всех генов HSV, но способные к репликации.
Конструкции векторов, используемых для переноса экзогенных ДНК в клетки человека, постоянно совершенствуются в зависимости от типа клеток-
мишеней. Так, новый тип векторов, сконструированных на основе псевдоаденовирусов, сочетает в себе все преимущества аденовирусных векторов, но при этом собственные вирусные гены практически не оказывают никакого повреждающего эффекта на трансформированные клетки-мишени,
так как содержат очень мало регуляторных элементов и последовательностей,
ответственных за упаковку и репликацию аденовируса. Кроме того,
псевдоаденовирусные векторы с успехом переносят чужеродные последовательности ДНК как в делящиеся, так и в покоящиеся клетки.
Изучаются также перспективы использования для генной терапии других вирусных систем, таких как SV40, HIV (ВИЧ), вирус ветряной оспы и др. В
частности, представляются перспективными эписомные (неинтегрирующиеся в геном реципиента) векторы, полученные на основе очень крупного вируса Эпштейна-Барра, который способен нести вставку размером от 60 до 330 тыс.
п.о.
В последнее время, особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих (Mammalian Artificial Chromosomes, MAC), которые могли бы достаточно автономно находиться в ядре, сохраняя способность к репликации и экспрессии. Удобными моделями для этого представляются циркулярные микрохромосомы раковых клеток.
Особенно привлекательной в отношении генной коррекции представляется возможность замены всего мутантного гена или его мутировавшей части (например, одного экзона) на его нормальный аналог, что может быть достигнуто с помощью гомологической рекомбинации. Такой подход может обеспечить не только продолжительную персистенцию введенного гена, но и сохранение удовлетворительного уровня его экспрессии.
С этой целью, в конструкции, используемые для переноса ДНК, включают агенты, повышающие частоту гомологичного спаривания, например, ген бактериальной рекомбиназы. В таких условиях частота гомологичной рекомбинации может быть достаточной для того, чтобы с помощью ПЦР отобрать нужные клоны клеток.