ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДНК-ТЕХНОЛОГИЙ В МЕДИЦИНЕ - МЕТОДЫ ПЦР И СЕКВЕНИРОВАНИЯ. ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ

1.3.1.2.3 Пробы с инвертированными концевыми повторами (ИКП) (молекулярные "маячки", molecular beacons)

В данной методике флуорофор и гаситель располагают на противоположных концах олигонуклеотида. Зонды, находящиеся в растворе при температуре ниже 55-60°С образуют структуру типа "стебель-петля" с

очень низким уровнем флуоресценции. При гибридизации с ампликоном зонд разворачивается, что ведет к увеличению уровня флуоресценции (Рис. 13).

Рис. 13 Схема работы молекулярных "маячков"

1.3.1.2.4 Метки, работающие на основе метода флуоресцентного резонансного переноса энергии (fluorescent resonance energy transfer, FRET).

В данной методике используются 2 олигонуклеотидных зонда, каждый из которых помечен своим флуорофором, один из которых имеет максимум поглощения в более коротковолновой, а другой в более длинноволновой части спектра. Метки подбираются таким образом, чтобы максимум эмиссии флуорофора с более коротковолновым максимумом поглощения был близок к максимуму поглощения второго флуорофора. Таким образом, один зонд несет флуорофор-донор, а другой - флуорофор-акцептор флуоресценции.

Последовательность зондов задается таким образом, чтобы они могли гибридизоваться с матричной ДНК в непосредственной близости друг от друга.

Гибридизация двух зондов с матрицей ведет к сближению флуорофоров и к туннельному переносу энергии с донора на акцептор (Рис. 14). Детекцию продуктов амплификации ведут посредством регистрации флуоресценции флуорофора-акцептора при длине волны возбуждения флуорофора-донора.

Данный подход наиболее широко используется при анализе однонуклеотидных полиморфизмов (single nucleotide polymorphisms, SNPs).

Рис. 14 Детекция продуктов ПЦР методом FRET

1.3.2 Определение эффективности амплификации

Из уравнения (3) видно, что эффективность реакции можно рассчитать как E=10-1/k, где k берется из уравнения прямой Ct = k·log P0 + b, полученного путем линейной аппроксимации экспериментальных данных. При E=2 (максимально теоретически возможном значении) k ~ -3.32.

Значения k < -3.32 соответствуют более низкой эффективности реакции.

Желательно добиваться таких условий реакции, в которых эффективность амплификации составляет, по меньшей мере, 1.7 - 1.8 (k не больше -4 — -4.2).

С другой стороны, иногда k оказывается больше, чем -3.32, что соответствует теоретически невозможной ситуации E > 2. Небольшое превышение (-3.32 < k < -2.8) наблюдается относительно часто и может быть отнесено на счет погрешности измерений.

1.3.3 Обработка данных ПЦР в реальном времени

Методы обработки данных ПЦР в реальном времени основаны на применении уравнения (3). Существует два основных метода обработки данных ПЦР в реальном времени:

-Метод калибровочного графика.

-Прямое сравнение данных.

1.3.3.1Метод калибровочного графика

Этот метод предполагает построение калибровочного графика в координатах Ct - log P0 с серией разведений ДНК-стандарта, из которого находят концентрацию субстрата (P0) в экспериментальных образцах.

1.3.3.2 Прямое сравнение данных

Из уравнения (3) следует, что при равной эффективности реакции E в

образцах 1 и 2, относительная концентрация субстрата (R) будет равна:

Проведем нормализацию этих результатов по данным амплификации с контрольной последовательностью REF (соответствующей, например, гену домашнего хозяйства). Пусть реакция REF в обоих образцах протекает с эффективностью Eref. Тогда:

,

= ∆ / ∆ (4)

)

Если эффективности "контрольной" и "опытной" реакций сходны, то можно записать:

можно использовать последовательность генов домашнего хозяйства, однако нужно иметь в виду, что уровень экспрессии генов домашнего хозяйства порой довольно значительно варьирует в разных тканях. Лучше всего проводить нормализацию по усредненным данным амплификации нескольких генов домашнего хозяйства.

1.4 Мостиковая ПЦР

В случаях, когда поставленные задачи требуют проведения высокоэффективного секвенирования, 1536-ти луночного планшета (или даже сотни таких планшетов) для ПЦР оказывается недостаточно. В таких случаях

требуются миллионы отдельных реакций, в каждой из которых будет получен гомогенный продукт ПЦР.

Одним из методов, позволяющих решить данную задачу, является мостиковая ПЦР (bridge PCR). Принцип данного метода заключается в проведении ПЦР с праймерами, прикрепленными к твердой подложке,

наподобие предметного стекла. С пришитого к поверхности праймера синтезируется фрагмент ДНК. После этапа денатурации, фрагмент снова взаимодействует с праймером на поверхности, образую дугу (мостик) между двумя точками на подложке (Рис. 15).

Рис. 15 Принцип действия мостиковой ПЦР

При повторных циклах ПЦР, из точки синтеза первого фрагмента колония фрагментов ДНК будет быстро расти.

Технология мостиковой ПЦР используется для создания клональных библиотек фрагментов ДНК в приборах компании Illumina.

1.5 Эмульсионная ПЦР (emulsion PCR, ePCR)

Эмульсионная ПЦР представляет собой распространенный вариант клонирования фрагментов ДНК in vitro. Эта методика позволяет амплифицировать ДНК на покрытых праймерами микросферах, так что каждая микросфера оказывается "облеплена" фрагментами только одного типа. Для этого создают библиотеку фрагментов ДНК с адаптерами по концам, а затем смешивают полученные фрагменты с покрытыми праймерами микрофсерами,

свободным праймером, и остальными необходимыми для ПЦР компонентами в условиях мелкодисперсной водно-масляной эмульсии так, чтобы в каждую микрокаплю воды попали в среднем одна микросфера и один "стартовый"

фрагмент ДНК. В ходе ПЦР, праймеры на микросфере инициируют синтез фрагментов, начиная с единственной матрицы, а с праймера, находящегося в

матрицы, при этом не требуются использовать стандарты. Данный метод незаменим для решения таких задач, как определение редких последовательностей ДНК, например, соматических мутаций клеток опухолей в парафинизированных гистологических срезах и биоптатах, даже при низком количестве целевой ДНК, выявление наличия циркулирующих опухолевых клеток в очень небольшом титре у пациентов, высокоточное определение количества копий гена, анализ экспрессии генов и miRNA единичных клеток в неоднородных популяциях, оценка качества приготовления образцов для высокопроизводительного секвенирования (секвенирования нового поколения, new generation sequencing, NGS) для улучшения качества результатов сиквенса,

выявление загрязнения даже единичными бактериальными клетками или вирусными частицами.

Преимуществами цифровой ПЦР по сравнению с ПЦР в реальном времени являются:

-прямое обнаружение редкого варианта мишени в сложном окружении;

-исключительная чувствительность и точность даже при анализе единичных молекул ДНК;

-отсутствие калибровочных кривых и отсутствие эффекта первых циклов

ПЦР;

-низкая чувствительность к присутствию ингибиторов.

2.Методы секвенирования нуклеиновых кислот

2.1.Метод химической деградации (Максама-Гилберта)

Метод определения последовательности нуклеотидов в нуклеиновых кислотах (НК), основанный на нуклеотид-специфической химической деградации при обработке ДНК различными химическими агентами был предложен в середине 70-х годов ХХ века исследователями гарвардского университета (США) Алланом Максамом и Уолтером Гилбертом.

Данный метод был первым из подходов, предложенных для анализа нуклеотидных последовательностей. На первом этапе образец ДНК, обычно представляющий собой сравнительно короткий (100 - 1000 п.н.) гомогенный

фрагмент, полученный, например, вырезанием полосы из геля после электрофоретического разделения образца ДНК, подвергнутого фрагментации с помощью эндонуклеаз, с одного из концов метят радиоактивной меткой. Затем образец разделяют на 4 части, после чего каждую из частей обрабатывают своим реагентом, приводящим к гидролизу ДНК по определенным основаниям

(или по сочетаниям оснований). Параметры каждой реакции подбирают таким образом, чтобы гидролиз проходил не полностью, а лишь по некоторым позициям в каждой молекуле ДНК (в среднем, желательно получить одну модификацию на отдельную молекулу). В результате получают набор расщепленных фрагментов ДНК, соответствующих по длине местам нахождения нуклеотидов данного типа (Рис. 18).

Рис. 18 Принцип метода Максама-Гилберта

Расщепление одинаковых, помеченных с одного из концов, фрагментов ДНК по разным позициям дает фрагменты разной длины, затем фрагменты могут быть разделены с помощью электрофореза

Например, реакция определения положения гуанина выглядит так: при помощи диметилсульфата проводят метилирование ДНК, в результате которого гуанин метилируется по положению 3, а аденин - по положению 7. Дальнейшая обработка соляной кислотой при 0°С приводит к выпадению из цепи

метиладенина (апуринизация по остаткам аденина). Такую ДНК с "пустыми"

остатками дезоксирибозы в позициях, где был аденин, можно гидролизовать при нагревании в щелочи. Гидролиз в случае с метилгуанином осуществляется при помощи пиперидина. Модификации по пиримидиновым основаниям (C и

Т) проводят с гидразином. Если реакцию проводить в присутствии NaCl,

модификация затронет только C. Гидролиз обработанной гидразином ДНК проводят пиперидином.

После обработки, все четыре образца наносят на параллельные дорожки денатурирующего полиакриламидного геля (ПААГ), и проводят электрофорез таким образом, чтобы получить разделение фрагментов, отличающихся на один нуклеотид. Далее с помощью рентгеновской пленки получают электрофореграмму, по которой можно восстановить последовательность нуклеотидов, исследуемого фрагмента ДНК, отсчитывая, в какой из 4-х

дорожек оказался фрагмент, следующий за самым легким продуктом, т.е.

обладающим наибольшей электрофоретической подвижностью. Таким способом удается определить последовательность до 200 нуклеотидов за одно прочтение.

В настоящее время метод Максама-Гилберта почти не используется в виду сложности пробоподготовки и необходимости работы с вредными реактивами. В основе большинства используемых на сегодняшний день методов секвинирования ДНК лежит метод терминаторов (метод Сэнгера). Тем не менее, метод Максама-Гилберта имеет ряд неоспоримых преимуществ,

главными из которых являются его полная независимость от вторичных структур и отсутствие необходимости знания участка последовательности,

интересующей исследователя ДНК. В связи с этим, до последнего времени,

метод Максама-Гилберта использовался в случаях, когда фермент ДНК-

полимераза не мог пройти через вторичную структуру в исследуемом образце ДНК, например через псевдоузел.

положении дезоксирибозы и вследствие этого не способны к присоединению ДНК-полимеразой следующего нуклеотида. Фрагмент ДНК,

последовательность которого требуется определить, добавляется в реакцию аналогичную ПЦР: реакционная смесь включает термостабильную ДНК-

полимеразу, dNTP всех четырех типов и праймеры, выступающие в качестве затравок для синтеза дочерних цепей ДНК.