ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДНК-ТЕХНОЛОГИЙ В МЕДИЦИНЕ - МЕТОДЫ ПЦР И СЕКВЕНИРОВАНИЯ. ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ

Рис. 7. Примеры обычного (А) амплификатора С1000 Touch, BioRad (США) и

детектирующего амплификатора CFX96 Touch, BioRad (США)

1.2.2Формат пробирок для проведения ПЦР

Внастоящее время используют 4 стандартных формата отдельных или стрипованных пробирок для ПЦР: 0,5 мл (0,6 мл), 0,2 мл, 0,025 мл (384-

луночный формат) и 0,01 мл (1536-луночный формат), а также широкий ассортимент нестандартных емкостей для проведения реакции. Пробирки по 0,5

мл и 0,2 мл бывают отдельными, скрепленными по 8 или 12 шт (в "стрипах") и

в виде 96-луночных планшетов. Форматы 0,025 мл и 0,01 мл существуют только в виде 384-луночных или 1536-луночных планшетов. Пробирки на 0,5

мл и 0,2 мл выпускают с различной толщиной стенок. На толщину стенок используемых пробирок следует обращать особое внимание, поскольку данный параметр существенно влияет на точность расчета температуры реакционной смеси при использовании регулирования температуры реакционной смеси по математической модели. Некоторые амплификаторы позволяют учесть толщину стенок используемых пробирок в формуле расчета.

1.2.3 "Горячий старт" (HotStart)

Несмотря на то, что оптимальная температура для действия большинства используемых для ПЦР ДНК полимераз составляет 60-80°С, большая часть из них сохраняет активность при комнатной температуре. Поскольку компоненты реакции, как правило, смешивают при комнатной температуре, в момент приготовления реакционной смеси праймеры могут неспецифично отжигаться на всегда присутствующую в очищенной ДНК одноцепочечную фракцию или

же друг на друга и удлиняться ДНК-полимеразой еще до начала ПЦР. В

результате могут появляться неспецифичные фрагменты, эффективно амплифицируемые в ходе последующей реакции. Для предотвращения такого эффекта существует несколько подходов, обозначаемых как "горячий старт".

1.2.3.1 Добавление одного из компонентов реакции при высокой температуре.

Наиболее простым способом является добавление одного из необходимых для реакции компонентов только после достижения реакционной смесью высокой температуры (70 - 95°С). Такими компонентами могут быть:

ДНК-полимераза, Mg2+ (образуют растворимые комплексы с dNTP и

формируют субстрат для ДНК-полимеразы), dNTP или праймеры. Данный подход удобен при небольшом числе реакций в одном эксперименте. Минусом подхода является повышенная ошибка в количестве отдельно добавляемого компонента.

1.2.3.2 Разделение барьером

Для достижения "горячего старта" можно отделить один из необходимых для ПЦР компонентов барьером, исчезающим при высокой температуре. Чаще всего такой барьер делается из парафина путем разделения смеси на 2 отсека парафиновой пробкой, либо за счет помещения одного из компонентов (Mg2+

или ДНК-полимеразы) внутрь парафиновых шариков. Данный подход применим для масштабных экспериментов. К минусам данной методики можно отнести сложность использования автоматических дозирующих станций для приготовления реакций с парафиновым барьером.

1.2.3.3 Ингибирование полимеразы антителами

При температурах ниже 50-60°С можно блокировать работу полимеразы путем ее связывания с антителами. Для этого используют моно- и

поликлональные антитела (обычно мышиные) к ДНК-полимеразе. В

зависимости от качества антител используют смеси от 1:1 до 1:10 по количеству молей фермента и антител, соответственно. ДНК-полимеразу обычно хранят в заранее изготовленной смеси с антителами, используя эту смесь для приготовления реакций. При нагревании реакционной смеси в ходе

первого цикла ПЦР антитела инактивируются и ДНК-полимераза начинает действовать.

1.2.3.4 Использование химически модифицированной полимеразы

Ковалентное присоединение термоили рН-лабильных химических групп к некоторым аминокислотам ДНК-полимеразы обратимо ингибирует её активность. При 95°С во время первого цикла ПЦР такие химические группы отделяются и фермент начинает работать. Для эффективной активации фермента, как правило, необходима инкубация реакционной смеси перед началом реакции при 95°С в течение 5-20 мин.

1.2.3.5 Использование ингибиторов ДНК-полимеразы

ДНК-полимеразу можно также обратимо ингибировать модифицированными олигонуклеотидами, обладающими высокой константой связывания с ферментом и диссоциирующими из комплекса при сравнительно высоких температурах.

1.3 ПЦР в реальном времени (Real-Time-PCR, qPCR, qRT-PCR)

Поскольку в ходе ПЦР происходит наработка определенного участка ДНК, по окончании реакции можно зарегистрировать полученный фрагмент при помощи ряда методов, наиболее популярным из которых является метод электрофореза в геле с окрашиванием ДНК бромистым этидием.

Однако регистрация результата реакции по ее завершении не дает информации об эффективности процесса. Поэтому применение классической ПЦР ограничено задачами, в которых достаточно получения ответа по принципу "да

-нет".

Вначале 1990-х гг. было предложено регистрировать накопление ДНК непосредственно в ходе ПЦР с целью количественного определения исходного числа ДНК-матриц, попавших в реакционную смесь. Для регистрации процесса амплификации в режиме реального времени в реакционную смесь добавляют флуоресцирующие и/или интеркалирующие красители, такие как SYBRGreen, SYBRBlue или ROX, по интенсивности флуоресценции которых можно судить об эффективности процесса амплификации (Рис. 8). Использование оптической

детекции также исключает необходимость стадии электрофореза. Кроме того,

флуоресцентные методы позволяют избирательно регистрировать амплификацию лишь определенных фрагментов ДНК, что повышает достоверность исследования.

Рис. 8.Детекция кинетики ПЦР в реальном времени с помощью флуоресцентных зондов.

Экспоненциальная стадия ПЦР описывается уравнением:

условиях E = 2, т.к. на каждом цикле ПЦР происходит удвоение количества продукта.

Прологарифмировав обе части уравнения (1) получим:

пороговым циклом (threshold cycle, C )) такой цикл n, на котором

достигается некий заданный уровень репортерной флуоресценции - пороговая флуоресценция PCt = const. Для n=Ct уравнение 2 принимает вид:

субстрата. Таким образом, ПЦР в реальном времени позволяет сравнивать количества субстрата при условии, что эффективность реакции и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций.

Однако величина Сt может зависеть от многих случайных факторов,

например чувствительности детектора, качество фильтра. Поэтому точно начальное количество интересующего продукта померить нельзя. Для решения этой проблемы существуют методы нормировки. Измеряют отношение количеств двух молекул в пробе. Нормализацию обычно проводят по продуктам амплификации так называемых генов домашнего хозяйства

(housekeeping genes) уровень экспрессии которых в клетке всегда примерно одинаков.

Вместе с тем, классическая ПЦР сохраняет свою актуальность в методиках, требующих наработки фрагментов ДНК с целью их дальнейшего использования (клонирования или секвенирования). В этих случаях,

присутствие интеркалирующих красителей может помешать последующим процедурам.

1.3.1 Детекция амплификации ДНК в режиме реального времени

Все существующие режимы регистрации накопления продуктов ПЦР в режиме реального времени основаны на измерении флуоресценции реакционной смеси таким образом, чтобы интенсивность флуоресценции была пропорциональна количеству наработанной в ходе реакции ДНК.

Способные к флуоресценции молекулы (флуорофоры) поглощают свет одной длины волны и испускают свет в более длинноволновой части спектра,

что следует из основного постулата квантовой механики:

= = ,

где E - энергия фотона, h - постоянная Планка, λ - длина электромагнитной волны, υ - частота электромагнитных колебаний, c - скорость света в вакууме.

Длины волн поглощения и испускания, а также количество поглощенного и испущенного света являются характеристикой каждого флуорофора и могут существенно различаться для разных соединений, что делает возможным независимо детектировать в системе сигналы сразу от нескольких флуорофоров.

Поглощение света флуорофором переводит электроны отдельных атомов этого химического соединения на более высокие энергетические уровни

1.3.1.1.1 Интеркалирующие красители

Использование интеркалирующих красителей (интеркаляторов)

представляет собой наиболее дешевый и простой вариант окраски ДНК для проведения ПЦР в реальном времени. Интеркалирующие красители - это соединения, приобретающие способность флуоресцировать при встраивании в двухцепочечную ДНК. В настоящее время существует множество коммерчески доступных интеркаляторов: бромистый этидий, YOYO, SYBR Green. наиболее часто встречающийся в молекулярно-биологической лаборатории интеркалятор

- бромистый этидий, применяемый для окрашивания ДНК при электрофорезе.

Однако он плохо подходит для регистрации накопления ДНК в ходе реакции,

поскольку негативно влияет на эффективность ПЦР. Наиболее распространенным вариантом красителя для ПЦР в реальном времени является

SYBR Green I.

Несмотря на удобство в работе, метод использования интеркаляторов обладает существенным недостатком, поскольку интеркалирующие красители

"проявляют" накопление любой ДНК, включая димеры праймеров. Поэтому образование флуоресцентного сигнала в ходе реакции не позволяет исследователю быть уверенным, что в результате амплификации наработан целевой фрагмент. Специфичность полученного продукта реакции в данном случае можно попытаться оценить с помощью анализа кривых плавления. Для этого, после окончания ПЦР пробирку медленно нагревают от 40°С до 95°С (или наоборот охлаждают от 95°С до 40°С) и одновременно регистрируют изменение флуоресценции (Рис. 9).

Рис. 9 Кривая плавления продуктов ПЦР (сплошная линия). Прерывистой линией показан график первой производной. Значения максимумов первых производных принимаются за температуру плавления ампликонов.

Фрагменты ДНК различной длины и состава будут плавиться

(гибридизоваться) при разной температуре, что позволяет приблизительно оценить состав реакционной смеси после ПЦР. Данный подход имеет низкую разрешающую способность и обычно используется для различения димеров праймеров и длинных продуктов ПЦР.

1.3.1.1.2 Меченные праймеры с адаптерной последовательностью (амплифлюры)

Существует несколько вариантов использования адаптерных 5ʹ-концевых последовательностей для регистрации накопления продукта ПЦР с участием флуоресцентно меченного праймера. В наиболее простом варианте, праймер несёт дополнительную последовательность на 5ʹ-конце, способную образовывать шпилечную структуру (Рис. 10).

Рис. 10 Схема работы праймеров "амплифлюр"

а - праймер содержит 5ʹ-адаптер с инвертированным повтором, по краям которого расположены флуорофор и гаситель флуоресценции. При температуре элонгации,

инвертированный повтор образует шпилечную структуру в которой флуорофор и гаситель оказываются сближены. В ходе синтеза второй цеп ДНК, шпилечная структура

"разворачивается" и интенсивность флуоресценции возрастает. б - праймер содержит меченный 5ʹ-адаптер, комплементарный дополнительному олигонуклеотиду с гасителем.

Синтез второй цепи "сталкивает" олигонуклеотид с гасителем.

Праймеры несут флуоресцентную метку (флуорофор) и гаситель флуоресценции, расположенные так, что при образовании шпилечной структуры флуорофор и гаситель оказываются пространственно сближенными.

В растворе праймеры сохраняют структуру шпильки, имеющую низкий уровень

флуоресценции. В ходе реакции, шпилька меченного праймера раскрывается

(поскольку меченный праймер становится частью двухцепочечного продукта),

что приводит к усилению флуоресценции. Существует также вариант этого метода, при котором гаситель флуоресценции находится на отдельном нуклеотиде, комплементарном 5ʹ-концевой адаптерной последовательности. В

этом случае, при встраивании праймера в ДНК гибридизация с гасящим олигонуклеотидом оказывается невозможной.

1.3.1.2 Специфические системы детекции

Поскольку даже хорошо подобранная пара праймеров может давать нежелательные продукты амплификации (например, димеры праймеров)

использование методик с регистрацией накопления только "нужных"

фрагментов ДНК является более надежным экспериментальным подходом. Все специфические системы детекции продуктов ПЦР отличаются наличием в реакционной смеси меченного олигонуклеотида (одного или нескольких),

неспособного выступать в качестве затравки и комплементарного уникальной части амплифицируемой последовательности. Меченный олигонуклеотид может быть прикреплен к праймеру или находиться в растворе в свободной форме. К специфическим системам детекции относятся праймеры-пробы

("скорпионы"), линейные разрушаемые пробы (TaqMan), пробы с инвертированными концевыми повторами (ИКП) (молекулярные "маячки", molecular beacons), а также системы меток, работающих на основе метода FRET.

1.3.1.2.1 Праймеры-пробы ("скорпионы")

В основе данного методы лежит идея объединения праймера и гибридизационной пробы в одну молекулу. Для этого к 5ʹ-концу праймера прикрепляется адаптер со структурой типа "стебель-петля", в котором петлевая часть адаптерной шпильки комплементарна внутренней части образующегося фрагмента (Рис. 11). Эта структура практически полностью повторяет праймеры типа "амплифлюр" с той лишь разницей, что адаптер отделен от праймера блокатором синтеза второй цепи ДНК во избежание его удвоения.

Рис. 11 Схема работы праймеров-скорпионов

Таким образом, после образования продукта реакции, петлевая часть адаптерной последовательности может гибридизоваться на внутреннюю часть фрагмента, что ведет к разобщению флуорофора и гасителя флуоресценции и,

как следствие, у усилению сигнала.

1.3.1.2.2 Линейные разрушаемые пробы (TaqMan)

В данном подходе, олигонуклеотид, комплементарный продукту ПЦР,

метят флуорофором и гасителем флуоресценции. В отсутствии мишени флуорофор и гаситель сближены и флуоресценция подавлена. При накоплении соответствующего продукта реакции, проба гибридизуется на ампликон, что ведет к ее разрушению за счет 5ʹ-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы

(Рис. 12).

Рис. 12 Схема действия механизма TaqMan

При этом интенсивность сигнала нарастает пропорционально увеличению количества ампликонов. В данном подходе, принципиальным моментом является использование ДНК-полимераз с хорошо выраженной 5ʹ-

экзонуклеазной активностью.