Матричные биосинтезы №2 Трансляция. Теория оперона

1

Тема занятия: «Матричные биосинтезы»

Трансляция. Теория оперона

1. Биосинтез белка (трансляция): основные этапы функционирования белоксинтезирующей системы (инициация, элонгация, терминация)

2. Посттрансляционные изменения полипептидных цепей и образование функционально-активных белков

3. Регуляция экспрессии генов у прокариот и эукариот. Теория оперона

4. Ингибиторы матричных биосинтезов, применение в медицине

5. Механизмы генетической изменчивости. Полиморфизм белков.

Наследственные болезни

1. Биосинтез белка (трансляция): основные этапы функционирования белоксинтезирующей системы (инициация, элонгация, терминация)

Синтез полипептидов, происходит на рибосомах. Рибосомы - немембранные самые мелкие клеточные органеллы. В клетке E.сoli присутствует около 103-5х103

рибосом. Линейные размеры прокариотической рибосомы 210 х 290 Å. У эукариот -

220 х 320 Å. Выделяют четыре класса рибосом:

1.Прокариотические 70S.

2.Эукариотические 80S.

3. Рибосомы митохондрий (55S - у животных, 75S - у грибов). 4. Рибосомы хлоропластов (70S у высших растений).

Структура рибосом

S - коэффициент седиментации или константа Сведберга. Отражает скорость осаждения молекул при центрифугировании в зависимости от конформации и молекулярного веса.

Каждая рибосома состоит из 2-х субъединиц (большой и малой).

3

т.е. получить максимальное количество «белковых копий». Для достижения этой цели на каждой мРНК может располагаться не одна, а несколько рибосом, встающих последовательно друг за другом и синтезирующих пептидные цепи. Такие образования называются полирибосомы.

Этапы биосинтеза белка на рибосоме

После считывания информации с ДНК и переноса ее на матричную РНК начинается синтез белков. Каждая зрелая мРНК несет информацию только об одной полипептидной цепи. Если клетке необходимы другие белки, то необходимо транскрибировать мРНК с иных участков ДНК. Биосинтез белков или трансляция происходит на рибосомах, внутриклеточных белоксинтезирующих органеллах, и

включает

5 ключевых элементов:

•матрица – матричная РНК

•растущая цепь – полипептид

•субстрат для синтеза – 20 протеиногенных аминокислот

•источник энергии – ГТФ

•ферменты – рибосомальные белки и рРНК

Выделяют три основных стадии трансляции: инициация, элонгация, терминация.

Инициация. Для инициации необходимы мРНК, ГТФ, малая и большая субъединицы рибосомы, три белковых фактора инициации (ИФ-1, ИФ-2, ИФ-3),

метионин и тРНК для метионина В начале этой стадии формируются два тройных комплекса: первый – мРНК, малая субъединица, ИФ-3; второй – мет-тРНК, ИФ-2,

ГТФ. После их объединения и присоединения большой субъединицы начинается стадия элонгации.

Элонгация. Для этой стадии необходимы все 20 аминокислот, тРНК для всех аминокислот, белковые факторы элонгации, ГТФ. Элонгация представляет собой циклический процесс, повторяющийся столько раз, сколько аминокислот необходимо

4

включить в полипептидную цепь. Удлинение цепи происходит со скоростью примерно 20 аминокислот в секунду.

Терминация. Синтез белка будет продолжаться до тех пор, пока рибосома не достигнет на мРНК особых терминирующих кодонов – стоп-кодонов УАА, УАГ,

УГА. Данные триплеты не кодируют ни одной из аминокислот, их также называют нонсенс-кодоны. Кроме стоп-кодонов для окончания синтеза белка требуются ГТФ и белковые факторы терминации, которые последовательно катализируют

1.Гидролитическое отщепление полипептида от конечной тРНК

2.Отделение от П-участка последней, уже пустой, тРНК,

3.Диссоциацию рибосомы.

Механизм трансляции

У прокариот перед каждым геном и соответственно в мРНК перед копией каждого гена имеется лидерная последовательность. Она может быть разного размера (до 160 нукл.) и разной первичной структуры, но обязательно содержит

полипуриновую последовательность Шайна-

Дальгарно, которая комплементарна 3'-концевому участку 16S rРНК.

Комплементарными могут быть 3-9 нуклеотидов.

Назначение комплементарного взаимодействия 3'-концевого участка 16S rРНК и последовательности Шайна-Дальгарно - правильная установка инициирующего кодона AUG на малой субъединице рибосомы. Инициирующий кодон находится на растоянии 3-10 нукл. от последовательности Шайна-Дальгарно.

К малой субъединице, на которой уже находится мРНК, подходит формилметиониновая тРНК,

соединенная с формилметионином. В результате образуется инициаторный комплекс: 30S

5

субъединица рибосомы + мРНК + формилметионовая тРНК-формилметионин.

Затем происходит ассоциация рибосомы. При этом изменяется конформация

16S rРНК и нарушается связь между ней и последовательностью Шайна-Дальгарно.

Аминоацильный конец формилметиониновой tРНК оказывается в Р-центре.

Второй кодон гена оказывается в Асп-центре.

Соответствующая ему аминоацил-tРНК устанавливается таким образом, что ее аминоацильный конец попадает в А-центр.

Пептидилтрансфераза отрывает формилметионин в Р-центре и переносит его в А-центр. Образуется пептидная связь между формилметионином и аминоацил-тРНК.

Рибосома претерпевает конформационные изменения и сдвигается на один кодон. Формилметиониновая тРНК покидает рибосому. Второй кодон оказывается напротив Р-центра. Сюда же переходит тРНК, несущая на хвосте дипептид. В Асп-

центр попадает третий кодон, а в А-центр очередная аминоацил-тРНК.

Теперь в Р-центре отрывается дипептид, переносится в А-центр и соединяется с третьей аминоацил-тРНК. Так продолжается до тех пор, пока в Асп-центр не приходит терминирующий кодон. Полипептид отрывается в Р-центре, переносится в А-центр и, т.к. присоединиться ему не к чему, он отваливается от рибосомы. Рибосома диссоциирует и малая субъединица сканирует мРНК.

In vivo на каждой стадии (образования инициаторного комплекса, инициации,

элонгации и терминации) участвуют различные белковые факторы, которые препятствуют посадке на рибосому деацилированных tРНК или запрещают посадку формилметиониновой-тРНК в А-центр. На всех этапах принимают участие молекулы

6

ГТФ, которые дефосфорилируются. Смысл гидролиза ГТФ не в отдаче энергии, а в

свидетельстве того, что данный этап трансляции пройден.

2. Посттрансляционные изменения полипептидных цепей и образование функционально-активных белков

Посттрансляционная модификация белков. Во время синтеза полипептидной цепи или после его завершения - белок самопроизвольно принимает свою нативную конформацию. Однако часто новообразованная полипептидная цепь не может принять окончательную биологически активную конформацию, пока она не подвергнется процессингу или ковалентной модификации. Изменения в ходе этих процессов получили название посттрансляционной модификации. У различных белков процессинг протекает по-разному.

1.Модификация N– конца и С – конца (удаление с N-конца метионина или даже нескольких аминокислот специфичными аминопептидазами). В прокариотических клетках все полипептиды начинаются с остатка N-формил-метилонина, а в эукариотических- с остатка метионина. Однако формильная группа инициирующий метионин, а часто и несколько следующих за ним аминокислотных остатков иногда удаляются с помощью особых ферментов и, таким образом, не обнаруживаются в окончательно сформированном белке. В некоторых белках после трансляции ацетилируется аминогруппа N – концевого остатка, в других модификации подвергается С - концевой остаток.

2.Удаление сигнальных последовательностей. Некоторые белки содержат на

N-конце дополнительную полипептидную последовательность из 15-30 остатков,

которая направляет этот белок к месту его назначения в клетке. Такие сигнальные последовательности удаляются с помощью особых пептидаз.

3.Частичный протеолиз – удаление части пептидной цепи, как в случае с инсулином или протеолитическими ферментами ЖКТ.

4.Образование дисульфидных мостиков между остатками цистеина. Во многих белках, предназначенных для выхода из эукариотической клетки, в процессе

7

формирования из нативной конформации появляются поперечные сшивки в результате ферментативного образования дисульфидных мостиков между остатками цистина; эти мостики соединяют друг с другом две полипептидные цепи или две части одной цепи. Поперечные дисульфидные мостики помогают уберечь нативную конформацию белковой молекулы от денатурации.

5. Присоединение химической группы к аминокислотным остаткам:

•фосфорной кислоты – фосфорилирование по сер, тре, тир используется при регуляции активности ферментов или для связывания ионов кальция

•карбоксигруппы – при участии витамина К происходит γ-карбоксилирование глутамата в составе протромбина, проконвертина, фактора Стюарта, Кристмаса, что позволяет связать ионы кальция при инициации свертывания крови.

•метильной группы – метилирование аргинина и лизина в составе гистонов используется для регуляции активности генома

•гидроксильной группы – образование гидроксипролина и гидроксилизина необходимо для созревания молекул коллагена

•йода – в тиреоглобулине присоединение йода необходимо для образования предшественников тиреоидных гормонов йодтиронинов.

•углеводных остатков – гликирование требуется при синтезе гликопротеинов

Фосфорилирование гидроксиаминокислот. В ряде белков гидроксильные группы некоторых сериновых, треониновых и тирозиновых остатков подвергаются ферментативному фосфорилированию с участием АТФ. Возникновение фосфосериновых, фосфотреониновых и фосфотирозиновых остатков в этих белках увеличивает их отрицательный заряд. В казеине, белке молока, содержится много фосфосериновых остатков, функция которых состоит в связывании ионов Ca2+.

Поскольку и ионы Ca2+, и фосфат, а также аминокислоты необходимы грудным детям,

казеин молока представляет собой источник этих трех незаменимых питательных веществ. Фосфорилирование гидроксильных групп определенных остатков серина необходимо для активации некоторых ферментов, например, гликоген-фосфорилазы.

Фосфорилирование специфических остатков тирозина некоторых белков происходит при онкогенезе.

8

Реакции карабоксилирования. К остаткам аспарагиновой и глутаминовой кислот в ряде белков могут присоединяться дополнительные карбоксильные группы.

Например, белок системы свертывания крови протромбин содержит в своей N–

концевой области несколько остатков γ-карбоксиглутаминовой кислоты, которые включаются в белок при помощи фермента, зависимого от витамина К.

Карбоксильные группы связывают ионы Ca2+, необходимые для запуска механизма свертывания крови.

Метилирование групп. В ряде белков определенные остатки лизина подвергаются ферментативному метилированию. Остатки монометил- и

диметиллизина обнаруживаются в некоторых мышечных белках и в цитохроме с. В

других белках метилированию подвергаются карбоксильные группы ряда остатков глутаминовой кислоты, что приводит к нейтрализации их отрицательных зарядов.

Присоединение боковых углеводных цепей. Боковые углеводные цепи гликопротеинов ковалентно присоединяются к полипептиду во время или после синтеза последнего. В одних гликопротеинах боковая углеводная цепь прикрепляется с помощью ферментов к остаткам аспарагиновой кислоты, в других - серина или треонина. Многие белки, которые работают вне клетки, а также «смазочные» протеогликаны, покрывающие слизистые оболочки, содержат боковые олигосахаридные цепи.

6. Добавление простетических групп. В состав многих ферментов входят обязательные для их активности ковалентно связанные с белком простетические группы; они также присоединяются к полипептидной цепи после того, как та покидает рибосому. Примерами таких простетических групп могут служить молекула биотина, ковалентно связанная с ацетил-СоА-карбоксилазой и гемовая группа цитохрома с.

Включение простетической группы:

•гема – при синтезе гемоглобина, миоглобина, цитохромов, каталазы

•витаминных коферментов – биотина, ФАД, пиридоксальфосфата и т.п.

7. Фолдинг – это процесс сворачивания полипептидной цепи в правильную

пространственную структуру. Для обеспечения фолдинга используется группа

9

вспомогательных белков под названием шапероны (chaperon, франц. – спутник). Они предотвращают взаимодействие новосинтезированных белков друг с другом,

изолируют гидрофобные участки белков от цитоплазмы, способствуют переходу вторичной структуры в третичную. При нарушении функции шаперонов и отсутствии фолдинга в клетке формируются белковые отложения – развивается

амилоидоз. Насчитывают около 15 вариантов амилоидоза.

8. Объединение протомеров в единый олигомерный белок, например,

гемоглобин, лактатдегидрогеназа.

9. Транспорт полипептидных цепей. Некоторые новообразованные белки поступают просто в клеточный цитозоль, другие направляются к различным клеточным органеллам, третьи секретируются из клетки, четвертые встраиваются в ту или иную клеточную мембрану, где работают в качестве транспортных белков или ферментов. Зрелый белок направляется в аппарат Гольджи, инкапсулируется и в виде секреторного пузырька покидает клетку. Многие другие экспортируемые белки,

функционирующие вне клетки, - белки плазмы крови, полипептидные гормоны,

антитела, мукопротеины – могут поступать к месту своего назначения аналогичным путем.

3. Регуляция экспрессии генов у прокариот и эукариот. Теория оперона

Регуляция транскрипции и трансляции у прокариот

Регуляция биосинтеза белка у прокариот осуществляется на уровне транскрипции мРНК. В

настоящее время принята теория оперона, сформулированная

Франсуа Жакобом и Жако Моно. В основе теории лежат следующие понятия:

конституитивные ферменты – те, которые присутствуют в клетках всегда,

независимо от ее активности

10

индуцибельные ферменты – те, которые синтезируются при появлении субстрата

оперон – группа тесно связанных между собой генов (несколько структурных генов и один ген-оператор), которые регулируют образование ферментов в организме

ген-регулятор – ген, регулирующий работу оперона, не входящий в его состав.

Лактозный оперон. При изучении E.coli было замечено, что активность одного

из ферментов катаболизма лактозы низка, если в среде имеется глюкоза. При отсутствии же глюкозы и при наличии лактозы активность фермента резко повышается. На основании этих наблюдений была предложена схема регуляции оперона по механизму индукции. В отсутствие лактозы активный белок-репрессор связывается с оператором и блокирует синтез мРНК, кодирующей ферменты катаболизма лактозы. В результате эти ферменты не образуются.

Если глюкозы нет, и есть лактоза, то последняя связывается с белком-

репрессором и модифицирует его, не позволяя связаться с геном-оператором. Это позволяет РНК-полимеразе считывать информацию, отвечающую за синтез ферментов катаболизма лактозы, и синтезировать мРНК. Таким образом, лактоза является индуктором транскрипции.

Схема негативной индукции Жакоба и Моно