Ферменты как биологические катализаторы

простетической группой, если он связан прочно с белковой частью ковалентными связями;

коферментом, если связан непрочными нековалентными связями и может легко отделяться от апофермента. Кофермент способен к самостоятельному существованию.

Апофермент:

обеспечивает специфичность действия;

определяет тип химического превращения субстрата;

повышает каталитическую активность кофактора.

Кофактор

находится в каталитическом участке активного центра;

участвует в катализе, являясь посредником между ферментом и субстратом;

стабилизирует: белковую часть фермента, его активный центр, молекулы субстрата. Например: ионы К+ стабилизируют третичную структуру пируваткиназы, ионы цинка – стабилизаторы алкогольдегидрогеназы, ионы Са2+ - активаторы фермента протеинкиназы С.

Коферментами в двухкомпонентных ферментах являются большинство витаминов (например, E, K, B1, B2, B6, B12, C, H и др.) и витаминоподобных веществ, а также соединения, построенные с участием витаминов (коэнзим А, НАД+ и др.). Кроме того, коферментами могут быть: HS-глутатион, представители многочисленной группы нуклеотидов и их производных, фосфорные эфиры некоторых моносахаридов и ряд других веществ. Один и тот же кофактор в составе одного фермента может быть простетической группой, а составе другого - коферментом. Например: ФАД – у оксидазы аминокислот – является кофактором, а в составе ферментов цепи переноса электронов – простетической группой. Кофактор и апофермент по отдельности каталитической активностью не обладают.

14

6. Механизм действия ферментов.

Для того, чтобы произошла реакция молекулы должны столкнуться и обладать необходимым запасом энергии. Энергетический уровень реакции – это запас энергии, которым должны обладать молекулы, чтобы их столкновение стало эффективным (чтобы произошла химическая реакция). Этот запас энергии является постоянной величиной для каждой реакции. Средний энергетический уровень молекул – это энергия, которой обладает большинство молекул системы в данный момент времени. Молекулы постоянно находятся в движении, поэтому их энергетический запас постоянно изменяется и колеблется около величины, называемой средним энергетическим запасом энергии. В каждый момент времени наибольшая доля молекул обладает именно таким запасом энергии. Разность между средним энергетическим уровнем молекул и энергетическим уровнем реакции называется энергетическим барьером или энергией активации. Иначе, энергия активации представляет собой “энергетический барьер”, который нужно преодолеть для того, чтобы произошла реакция.Чем больше эта энергия активации, тем медленнее протекает реакция.

Преодолев “энергетический барьер” молекула переходит в промежуточное состояние, называемое а к т и в и р о в а н н ы м комплексом или п е р е х о д н ы м с о с т о я н и е м. В переходном состоянии возможно одновременное образование новых и разрыв старых химических связей.

Повышение среднего энергетического уровня молекул возможно за счет повышения температуры, поглощения ими лучистой энергии, столкновения их с другими возбужденными молекулами, но в живых организмах это невозможно, поскольку они функционируют при постоянных значениях температуры, давления и других параметрах. В живых организмах эту роль выполняют ферменты. Ферменты ускоряют реакцию направляя ее по такому пути, на котором энергетические барьеры ниже. Энергия, необходимая для «подъема» молекулы от среднего энергетического уровня реакции полностью

компенсируется при самостоятельном «скатывании» молекулы по склону

15

«вулкана», то есть, до среднего энергетического уровня продуктов реакции. Выделяемая при этом энергия называется тепловым эффектом реакции. В присутствии катализатора понижается энергия активации.

На первом этапе фермент сближается только с тем субстратом который по структуре соответствует структуре его активного центра (модель Фишера «ключ к замку»), далее субстрат, взаимодействуя с активным центром фермента, вызывает изменение его конформации, приводя к образованию фермент-субстратного комплекса, При этом молекула субстрата также изменяет свою конформацию, что обеспечивает более высокую эффективность ферментативной реакции (этап индуцированного соответствия - модель Кошланда). Эти два этапа обратимы. На третьем этапе происходит разрыв старых связей и образование новых с образованием продукта реакции, который по структуре не соответствует структуре активного центра, поэтому на последнем этапе покидает его. Эти процессы можно описать уравнением:

16

I- этап: сближение и ориентации субстрата относительно актвного центра фермента;

IIэтап: образование фермент-субстратного комплекса (ES) в результате индуцированного соответствия.

IIIэтап: деформация субстрата и образование нестабильного комплекса фермент-продукт (ЕР)

IVэтап: распад комплекса (ЕР) с высвобождением продуктов реакции из активного центра фермента.

7. Основы кинетики ферментативных реакций.

Химическая кинетика - это учение о скоростях и механизмах химических реакций. Ферментативная кинетика изучает закономерности влияния химической природы реагирующих веществ (фермента, субстратов) и условий их взаимодействия (концентрация фермента, концентрация субстратов или ингибиторов) на скорость ферментативных реакций.

Скорость ферментативной реакции – это мера каталитической активности фермента, которую обозначают как активность фермента. На практике пользуются условными величинами, характеризующими активность фермента

Для выражения каталитической активности Комиссией по ферментам Международного биохимического союза (1961 г.) была рекомендована стандартная единица, обозначенная на русском языке - Е, а на английском - U.

одна международная единица активности фермента (МЕ) соответствует такому количеству фермента, которое катализирует превращение 1 микромоля (мкмоль) субстрата за 1 мин при оптимальных условиях проведения ферментативной реакции. Международная единица активности (МЕ или Unit) выражается мкмоль/мин.

17

В 1973 году была принята новая единица активности ферментов: 1 катал (1 кат), соответствующий такому количеству катализатора, которое превращает 1 моль субстрата за 1 сек. Количество каталов определяют по формуле:

Международная единица связана с каталом равенством: 1МЕ=16,67 нкат (нонакатал).

В медицинской практике для оценки активности часто используют международные единицы активности, а для оценки количества молекул фермента в ткани определяют удельную активность (уд.ак.) фермента.

Удельная активность – выражается в единицах активности, рассчитанной на 1 мг белка по формуле:

Например, известно,

что 1 гпепсинарасщепляет 50 кг яичного белка за один час – таким образом, его активность составит 50 кг/час на 1 г фермента,

если 1,6 мл слюны расщепляет 175 кг крахмала в час – активность амилазы слюнысоставит 109,4 кг крахмала в час на 1 мл слюны или 1,82 кг/мин×г или 30,3 г крахмала/ с×мл.

8. Влияние температуры.

Важным фактором, от которого зависит скорость ферментативной реакции (равно каталитическая активность фермента) является температураКаждый фермент имеет свою оптимальную температуру. Для ферментов животного происхождения она лежит между 37 и 40ОС, а

18

растительного - между 40 и 50ОС. Однако есть и исключения: -амилаза из проросшего зерна имеет оптимальную температуру при 60ОС, а каталаза - в пределах 0 - 10ОС. До этого интервала с повышением температуры скорость катализируемой реакции повышается из-за ускорения движения молекул и увеличения вероятности их столкновения. Выше оптимальной температуры активность ферментов понижается, а при температуре 50-60оС совершенно прекращается, фермент инактивируется из-за денатурации. При температуре выше 80ОС большинство ферментов полностью теряют свою каталитическую активность. Поэтому важным показателем, характеризующим отношение фермента к температуре, является его термолабильность, т.е. скорость инактивации самого фермента при повышении температуры. При низких температурах (0 ОС и ниже) каталитическая активность ферментов падает почти до нуля, но денатурация при этом не происходит. С повышением температуры их каталитическая активность вновь восстанавливается.

Температура, обеспечивающая наибольшую скорость реакции, называется о п т и м а л ь н о й температурой.

Зависимость активности ферментов от температуры описывается колоколообразной кривой с максимумом скорости при значениях оптимальной температуры для данного энзима.

Закон о повышении скорости реакции в 2-4 раза при повышении температуры на 10°С справедлив и для ферментативных реакций, но только в пределах до 55-60°С, т.е. до температур денатурации белков. Наряду с этим, как исключение, имеются ферменты некоторых микроорганизмов, существующих в воде горячих источников и гейзеров.

При понижении температуры активность ферментов понижается, но не исчезает совсем. Иллюстрацией может служить зимняя спячка некоторых животных (суслики, ежи), температура тела которых понижается до 3-5°С. Это свойство ферментов также используется в хирургической практике при проведении операций на грудной полости, когда больного подвергают охлаждению до 22°С.

19

Рис. 1. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры.

Влияние рН.

Для каждого фермента существует оптимальное значение рН, т.е. такая величина рН, или зона рН, при которой катализируемая ферментом реакция протекает с наибольшей скоростью.

Большинство ферментов имеют максимальную каталитическую активность в зоне рН от 7; в резко кислой или резко щелочной среде работают лишь некоторые ферменты. За пределами оптимальной зоны рН, т.е.

при отклонениях в сторону снижения или в сторону повышения от этого значения, скорость ферментативной реакции снижается.

При разных значениях рН активный центр может находиться в разной степени ионизированной или неионизированной форме, что сказывается на формировании активного фермент-субстратного комплекса. Кроме того, имеет значение факт ионизации субстатов и кофакторов.

При проведении производственных процессов можно путем соблюдения требуемого рН снизить активность нежелательных для процесса ферментов и повысить активность полезных ферментов.

Зависимость также описывается колоколообразной кривой с максимумом скорости при оптимальном для данного фермента значении рН. Для каждого фермента существует определенный узкий интервал рН среды, который является оптимальным для проявления его высшей активности. Например, оптимальные значения рН для пепсина 1,5-2,5, трипсина 8,0-8,5,

20

амилазы слюны 7,2, аргиназы 9,7, кислой фосфатазы 4,5-5,0, сукцинатдегидрогеназы 9,0.

Рис. 2. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН среды.

Зависимость скорости реакции от количества фермента.

При проведении ферментативной реакции в условиях избытка субстрата скорость будет зависеть прямо пропорционально от концентрации фермента.

Рис. 3. Зависимость скорость реакции от концентрации фермента.

При увеличении количества молекул фермента скорость реакции возрастает непрерывно и прямо пропорционально количеству фермента, т.к. большее количество молекул фермента производит большее число молекул продукта.

9. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата.

Ферментативный процесс условно можно выразить уравнением:

21

где k1- константа скорости образования фермент-субстратного комплекса, k-1- константа скорости обратной реакции распада фермент-субстратного комплекса, k2- константа скорости образования продукта реакции. Соотношение констант (k-1+k2)/k1 называют константой Михаэлиса и обозначают: Кm.

Рис. 4. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата.

При увеличении концентрации субстрата при постоянной концентрации фермента скорость реакции возрастает пропорционально увеличению концентрации субстрата (реакция первого порядка). При высоких концентрациях субстрата скорость реакции достигает своего максимального значение (Vmax) и не зависит от концентрации субстрата (реакция нулевого порядка). Графически эта зависимость описывается гиперболой. Эта кривая описывается уравнением Михаэлиса Ментен:

где Кm – константа Михаэлиса. Она численно равна той концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину от

22

максимального значения. С помощью Кm можно охарактеризовать сродство данного фермента к данному субстрату. Чем меньше Кm, тем больше сродство фермента к данному субстрату и выше скорость реакции. Если Кm высока, то сродство фермента к такому субстрату низкое и реакция протекает медленно.

23