ЛАБОРАТОРНОЕ ЗАНЯТИЕ №13 БИОМЕМБРАНОЛОГИЯ

ЛАБОРАТОРНОЕ ЗАНЯТИЕ № 13

Тема: БИОМЕМБРАНОЛОГИЯ

Цель работы

Исследовать одностороннюю проницаемость кожи лягушки для метиленового синего.

Студент должен изучить материал по теме и УМЕТЬ ответить на следующие вопросы:

1. Биологические мембраны. Строение и физические свойства биологических мембран.

2. Функции биологических мембран: матричная, транспортная, барьерная.

3. Виды пассивного транспорта.

4. Пассивный транспорт не электролитов. Уравнение Фика .

5. Пассивный транспорт электролитов. Уравнение Нернста-Планка.

6. Понятие об активном транспорте ионов через биологические мембраны.

Виды активного транспорта.

Исследование проницаемости кожи лягушки

Оснащение

Полые стеклянные цилиндры, лягушки, бюксы, термостат, фотоэлектроколориметр ФЭК-56, 0,65% раствор NaCl, 0,05% раствор метиленового синего, приготовленный на 0,65% растворе NaCl, нитки.

Краткая теория

Биологическая клетка окружена мембраной, обеспечивающей поддержание внутри клетки условий, необходимых для ее нормального существования. Из внешней среды клетки получают кислород и питательные вещества, в нее выделяют продукты жизнедеятельности. Взаимодействие клетки с окружающей средой происходит через мембрану. Поэтому для понимания процессов в организме при его нормальном функционировании, а также при различных патологиях важное значение имеет изучение строения и функций клеточных мембран.

Изучение механизмов транспорта веществ через клеточные мембраны имеет большое значение для медицины и биологии, так как нарушениями систем активного и пассивного транспорта объясняются причины многих заболеваний, а также действие лекарственных препаратов. Функция мембран – ключевая в любой патологии.

Химический контакт организма с внешней средой осуществляется через эпителиальные ткани, которые покрывают внешнюю поверхность тела и выстилают пищеварительную и дыхательную системы. Эпителиальные ткани представляют собой многомембранные системы, в которых происходит активный и пассивный транспорт различных веществ. Так, при пищеварении в клетки через пищеварительный тракт поступают аминокислоты, сахар, ионы, вода. При дыхании происходит транспорт газов, O₂ и CO₂ через альвеолярно-капиллярные стенки.

Проницаемостью называют способность клеток, тканей пропускать газы, воду и растворенные в ней вещества. Проблема проницаемости имеет важное значение для вопросов обмена веществ, распределения веществ между клеткой и средой, для патологии и фармакологии. В основе проникновения веществ в клетку и ткани лежит явление диффузии, описываемое уравнением Фика

(13.1)

Плотность потока вещества продиффундировавшего через биологическую мембрану прямо пропорционально концентрационному градиенту. Коэффициент пропорциональности - это коэффициент диффузии.

Коэффициент диффузии в явлениях проницаемости приобретает несколько иной физико-химический смысл. Так как здесь нет свободной диффузии, а вещество часто взаимодействует с мембраной, поэтому лучше коэффициент диффузии заменить коэффициентом проницаемости и ввести интенсивность потока вещества

(13.2)

Коэффициент проницаемости равен количеству вещества, переходящему в единицу времени через единицу поверхности при разности концентрации в 1 моль/л между наружным раствором и внутренним содержанием биологического объекта.

В соответствии с формулами (13.1) и (13.2) скорость диффузии должна экспоненциально уменьшаться по мере падения концентрационного градиента во времени и выравнивания встречных диффузионных потоков. Однако в действительности скорость проникновения в клетку того или иного вещества, как правило, никогда не падает, а поддерживается на постоянном уровне. Последний зависит от внешних условий (в частности, от концентрации вещества во внешней среде), а также от интенсивности обмена вещества, вовлекающего в свой круговорот молекулы проникающего вещества. Если какое-либо вещество, проникая в клетку, вступает в химическую реакцию или как-либо изменяет свое физико-химическое состояние, то скорость его проникновения в двух взаимно противоположных направлениях окажется неодинаковой. Подобное явление носит название односторонней проницаемости.

В основе односторонней проницаемости лежит:

1) физико-химическая лабильность частиц проникающего вещества, т.е. возможность их перехода из одного физико-химического состояния в другое. Например, из недиссоциированной (эти молекулы проникают в клетки быстрее) формы в диссоциированную (ионы); из окисленной в восстановленную форму; из свободной в связанную адсорбционную форму;

2) для односторонней проницаемости необходима физико-химическая асимметрия клетки и среды, т.е. различное численное значение физико-химических параметров (активная реакция, окислительно-восстановительный потенциал, адсорбционный уровень) в направлении диффузионного потока.

Наиболее удобны для исследования проницаемости пластинчатые органы и ткани. Классическим примером тканевой мембраны, обладающей односторонней проницаемостью для ряда слабых электролитов, является кожа лягушки, состоящая из соединительно-тканевых слоев, а также эпителиальных слоев.

Рассмотрим транспорт молекул через эпителий кожи лягушки. Кожа лягушки состоит из нескольких слоев эпителия, покрытого сверху слоем слизи (рис. 13.1). Под нижним слоем эпителиальных клеток находится внутренняя – базальная мембрана 1, а под ней – рыхлая соединительнаяткань, содержащая кровеносные сосуды и лимфатические узлы. Клетки эпителия имеют различную форму, постепенно уплощаясь к периферии кожи. Клетки внутреннего или базального слоя 2 имеют цилиндрическую форму. Клетки средних слоев – шиповидного 3 и гранулярного 4 – имеют кубическую форму. Сверху находится внешняя – апикальная мембрана 5, к ней примыкает слой ороговевших клеток. Между клетками существуют различные межклеточные контакты.

Рис. 13. 1. Эпителий кожи лягушки.

1- базальная мембрана, 2 – базальный слой, 3 – шиповидный слой,4 – гранулярный слой, 5 – апикальная мембрана.

Кожной мембране свойственна выраженная односторонняя проницаемость для красителей группы тиазинов (метиленовый синий) в направлении от соединительной ткани к эпителию.

Односторонняя проницаемость отнюдь не является раз и навсегда заданным присущим мембране свойством. Произвольно изменяя активную реакцию раствора красителя, а также и солевого раствора, прилегающего к коже с противоположной стороны, оказывается воз­можным усилить, ослабить, придавить одностороннее движение и даже изменить его на диаметрально противоположное.

Порядок выполнения лабораторной работы

1. Приготовить препарат изолированной кожи лягушки.

Лягушку удобно обездвижить, перерезая позвоночный столб, и тем самым спинной мозг. Однако иногда бывает нужно обездвижить животное, сохраняя позвоночный столб в целости. Тогда лягушку обездвиживают, разрушая, головной и спинной мозг зондом.

После обездвиживания с помощью ножниц вырежьте лоскутки кожи спинки и брюшка. Лоскуты кожи укрепите на расширен­ных концах двух стеклянных цилиндров с помощью ниток: на одном цилиндре эпителием наружу, на другом - эпителием внутрь.

В цилиндры с лоскутами кожи вылейте раствор хлористого натрия и убедитесь в герметичности. Затем вылейте раствор хлористого натрия и налейте одинаковое количество красителя. В это же время в 2 бюксы налейте раствор NaCl . Погрузите цилиндры в бюксы с раствором NaCl. Проследим, чтобы совпали! уровни раствора хлористого натрия в бюксе и раствора метиленового синего в стеклянном цилиндре

(рис. 13.2). Поместите в термостат. Кожные лоскуты инкубировать 3 часа при температуре 22⁰С.

Рис. 13.2. Схема постановки опыта по исследованию проницаемости кожи лягушки.

А – кожный лоскут, укрепленный на стеклянном цилиндре,

Б – кожный лоскут в бюксе с физиологическим раствором,

В – спектр поглощения водного раствора метиленового синего.

2. По истечении времени инкубирования профотометрируйте растворы, находящиеся в бюксах.

В левую и одну из правых кювет налейте раствор NaCl, соблюдая правила обращения с кюветами. В другую правую кювету раствор из бюксы, где кожный мешок был эпителием наружу.

Установите красный светофильтр фотоэлектроколориметра, потому что водный раствор метиленового синего имеет максимум поглощения при длине волны 660 нм (рис. 13.2, В).

Определите оптическую плотность растворов, содержащихся в одном и другом бюксе. Данные занесите в таблицу 13.1.

Таблица 13.1

Оптическая плотность растворов

Исследуемый объект
Эпителий наружу	Эпителий внутрь

3. Полученные данные представьте в виде диаграммы или графика с указанием погрешности.

Запишите вывод: ___________________________________________________

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________