УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ ПО ЦИТОЛОГИИ, ЭМБРИОЛОГИИ И ОБЩЕЙ ГИСТОЛОГИИ (1 СЕМЕСТР)
.pdfУплотнение объекта может осуществляться разными способами Заливка в парафин. После обезвоживания кусочек постепенно пропиты-
вается растворителем парафина, для чего проводится через так называемую «батарею» ксилолов (или какого-нибудь другого растворителя парафина — толуола, бензола или хлороформа). «Батарея» состоит из трех сосудов, содержащих смесь растворителя парафина с абсолютным спиртом в различных пропорциях (2 части абсолютного спирта — 1 часть ксилола; 1 часть ксилола + 1 часть абсолютного спирта; чистый ксилол). В чистом ксилоле кусочек делается совершенно прозрачным и переносится в так называемую снегоподобную массу (смесь парафина с ксилолом). Из снегоподобной массы кусочки переносятся последовательно в две ванночки с расплавленным парафином, в каждой из которых материал выдерживается по часу при температуре 54-560. После того, как парафин с кусочками застынет, кусочки с окружающим их парафином вырезаются и прикрепляются к металлическим блокам. Парафиновые блоки могут храниться неопределенно долго.
Заливка в целлоидин. После полного обезвоживания в абсолютном (1000) спирте кусочек пропитывают растворителем целлоидина. Для этого его переносят в смесь равных объемов абсолютного спирта и эфира. После этого его несколько суток пропитывают 2% раствором целлоидина, затем 4% и, наконец, заливают в 8-10% целлоидин. Густой (10%) целлоидин вместе с кусочком выливается в плоскую чашку, и кусочек остается там до тех пор, пока плотность целлоидина не приблизится к плотности кусочка. Затем кусочек с окружающим его целлоидином вырезается и приклеивается к деревянному бруску. Такой брусок с прикрепленным к нему кусочком ткани, впаянным в целлоидин, называется целлоидиновым блоком. Целлоидиновые блоки могут длительное время храниться в 700 спирте.
Микроскопические срезы с кусочков, залитых в парафин или целлоидин, делают при помощи особых приборов — микротомов. Санный микротом состоит из станины, на которой крепятся салазки с зажимом для ножа, столика с зажимами для блоков и регулятора с микрометрическим винтом для подъема столика. Особый (микротомный) нож, скользя в горизонтальной плоскости на салазках по рельсам станины, срезает с поверхности парафинового и целлоидинового блока тонкие листочки — срезы. После каждого движения ножа при помощи регулятора столик поднимается на определенное количество микронов, делается новый срез и т. д. С парафиновых блоков можно делать срезы гораздо более тонкие, нежели с целлоидиновых, можно также получить ленту (серию срезов), которую при заливке в целлоидин сделать трудно.
Когда требуется срочное микроскопическое исследование материала (биопсии) и для некоторых специальных окрасок (на жир, ферменты) используют метод замораживания. В этом случае кусочек объекта сразу кладется на столик замораживающего микротома и при помощи испарения жидкой углекислоты замораживается, что позволяет быстро сделать с него срезы.
10
Микроскопические препараты очень твердых объектов (кость, зуб) или, наоборот, полужидкой и жидкой консистенции (костный мозг, кровь) обычным методом изготовлены быть не могут, применение микротома в этих случаях нецелесообразно или невозможно.
В первом случае готовят так называемые шлифы — тонкие, прозрачные пластинки. Во втором случае размазывают жидкий или полужидкий материал тонким слоем по предметному стеклу, делая так называемые мазки, которые затем фиксируют, окрашивают и изучают под микроскопом.
Окраска. Красители, которыми пользуются гистологи, делятся на:
-основные,
-кислые и
-нейтральные.
Гистологические структуры кислой природы, окрашивающиеся основными красителями, называются базофильными.
Основные красители: гематоксилин (окрашивает в сине-фиолетовый цвет), сафранин (в красный), азур (в синий).
Структуры, окрашивающиеся кислыми красителями, называются оксифильными или ацидофильными. Кислые красители: эозин (окрашивает в ярко-розовый цвет, пикриновая кислота - в канареечно - желтый цвет, метиловый - зеленый - в зеленый цвет).
Нейтральные красители, например, брильянт крезил-блау, нейтральный красный. Базофильные элементы окрашиваются их основным компонентом, окси- фильные—кислым.
Одним из наиболее употребительных методов окраски является окраска гематоксилином (Караци или Бѐмера) — эозином.
Окрашивание парафиновых срезов гематоксилином-эозином:
1)растворение парафина ксилолом,
2)удаление ксилола из среза спиртом,
3)ополаскивание среза дистиллированной водой,
4)окраска гематоксилином в течение 3-х минут,
5)ополаскивание среза водопроводной водой (до посинения среза),
6)докраска эозином 0,5 — 7 минут,
7)обезвоживание в 96° спирте,
8)просветление в карбол-ксилоле и ксилоле.
Заключение в окончательную среду. После просветления среза в кси-
лоле на него наносится капля канадского бальзама и покрывается покровным стеклом. После того, как канадский бальзам засохнет, препарат может храниться много лет.
11
Для выявления специальных структур применяются специальные методы окраски. Так, для избирательного окрашивания нервной ткани используют метод импрегнации (пропитывания среза раствором азотнокислого серебра) или метод окрашивания метиленовой синью, разработанный А. С. Догелем. Для выявления клеточного центра материал окрашивают железным гематоксилином по Гейденгайну. Для выявления других структур клеток используют различные другие красители.
Гистохимические методы исследования
Основной целью гистохимических исследований является выявление тканевой локализации химических соединений и, следовательно, гистохимический анализ позволяет выявить в срезах биологических объектов
аминокислоты, нуклеиновые кислоты, различные виды углеводов, липидов, целый ряд ферментов. При помощи гистохимических методов исследования созданы «гистохимические карты» органов, давшие основные сведения об их гистофизиологии и цитофизиологии.
Подготовка материала к гистохимическому исследованию включает традиционные этапы: взятия материала, фиксации, промывки, обезвоживания и заливки в плотные срезы. Особенности проведения каждого этапа определены выбором исследуемых химических соединений и направлены на одновременную сохранность прижизненного состояния тканевых структур и выявляемых веществ. Гистохимические методы исследования гораздо менее специфичны, по сравнению с иммуноцитохимическими, однако отличаются простотой выполнения и дешевизной используемых реактивов. Некоторые гистохимические (как и иммуногистохимические) методы позволяют использовать замороженные срезы, изготовляемые из нефиксифрованного материала.
Некоторые гистохимические окраски
1.Жиры—суданом 3, шарлах-рот и осмиевой кислотой.
2.Гликоген — методом Шабадаша.
3.ДНК — методом Фѐльгена.
4.РНК — методом Браше (метиловым зеленым — пиронином).
5. Сукцинатдегидрогеназа (фермент, участвующий в цепи реакций окисления жиров, углеводов и белков) - методом Зелигмана и Рутенберга.
6. Щелочная фосфатаза (фермент гидролиза) - методом Гомори-Такаматсу.
Принципы и методы иммуноцитохимического анализа
Принцип иммуноцитохимического анализа основан на высокоспецифичном взаимодействии антигенов с антителами.
Антиген – это вещество, несущее признаки генетически чужеродной информации. Поэтому он (антиген) распознаѐтся иммунокомпетентной клеткой, как чужеродный (не свой) объект. Свойствами антигена обладают бактерии,
12
вирусы, паразиты, чужеродные клетки и ткани, мутационно-изменившиеся собственные клетки, продукты жизнедеятельности чужеродных клеток. В роли антигенов могут выступать как разнообразные химические соединения, находящиеся в тканях, так и отдельные клеточные структуры (ядро, органеллы цитоплазмы).
Антитела – иммуноглобулины, молекулы сложных белков, способные специфически соединяться с соответствующими антигенами.
Антитела синтезируются плазмоцитами, которые дифференцируются из В-лимфоцитов. При иммуноцитохимическом исследовании используются меченные антитела, ими выявляют антигены тканей.
Внастоящее время чаще используют моноклональные меченые антитела. Они идентичны по специфичности, сродству к антигенам, имеют стабильную молекулярную организацию. Продуцируются моноклональные антитела гибридомами, образованными слиянием В-лимфоцитов селезенки иммунизированного животного и клеток культуры миеломы того же животного. Гибридомы обладают свойством быстро неограниченно пролиферировать подобно опухоли. Одновременно они синтезируют антитела, как плазматические клетки.
Поскольку производство моноклональных антител и контроль за их качеством очень трудоѐмкий, в большинстве лабораторий пользуются готовыми антителами, производимыми зарубежными и отечественными фирмами.
Взависимости от того, чем метятся антитела, выделяют иммунофлюоресцентные, иммуноферментные, иммуноизотопные и другие методы исследования. Использование радиомеченных антител в одном и том же образце ткани позволяет одновременно выявить несколько разновидностей антигенов.
Для выявления мест связывания антигена с антителом используются светооптические и электронномикроскопические методы исследования.
Подготовка материала к изготовлению срезов и их окраска при иммуноцитохимических исследованиях имеют некоторые особенности. Основное требование – этапы, предшествующие окрашиванию должны максимально сохранять тканевые структуры, иммобилизовать антиген, максимально сохранив его антигенную активность.
Для фиксации чаще используются смеси, содержащие формальдегид (4 % параформальдегид, формол-солевую смесь, жидкость Буэна).
Принцип работы электронного микроскопа просвечивающего типа
В условиях вакуума источником потока электронов является катод. Между катодом и анодом имеется электрическое поле с разностью потенциалов в несколько десятков тысяч вольт, ускоряющем поток электронов, который конденсируется в узкий пучок в магнитном поле конденсорной линзы и попадает в объект исследования. Здесь электроны взаимодействуют с его веществом.
При этом наблюдается отклонение их траекторий движения - электроны рассеиваются.
13
Апертурная диафрагма, расположенная в объективной линзе, задерживает электроны, отклоненные на угол, превышающий апертурный (определяемый диаметром апертурной диафрагмы), и они не принимают участие в формировании изображения.
Первичное (или промежуточное) увеличенное изображение, полученное в магнитном поле линзы объектива, затем еще раз увеличивается проекционной линзой. Это конечное изображение, наблюдаемое на экране микроскопа, фиксируется на фотопластинках.
В современных электронных микроскопах для получения больших и плавно регулируемых увеличений между объективной и конденсорной линзой помещена промежуточная линза.
Техника обработки объектов для электронной микроскопии
Методы обработки исследуемого материала при электронномикроскопическом исследовании и световой микроскопии аналогичны. Только для электронномикроскопического (ультрамикроскопического) исследования необходима максимальная точность техники обработки объектов.
Фиксация. Материал для исследования желательно брать свежий, при температуре 0-4 0 С, маленькими кусочками объемом 1 мм3 . Продолжительность фиксации обычно колеблется в пределах 0,5-3 часов. Наиболее широко распространены в качестве фиксирующих жидкостей четырехокись осмия, глутаральдегид, марганцовокислый калий, параформальдегид и др. Фиксирующие вещества применяются обычно в водных растворах. Величина рН этих растворов поддерживается с помощью буфера (фосфатного, какодилатного и пр.), а физиологическое осмотическое давление создается добавлением некоторых осмотически активных веществ (сахарозы).
Обезвоживание. Используются обычно ацетон, метанол и этанол в возрастающих концентрациях. Поскольку они растворяют липиды, обезвоживание проводят быстро, чтобы избежать вымывание липидсодержащих компонентов клетки.
Заливка. В качестве заливочных средств в настоящее время широко используются эпоксидные смолы – аралдит и эпон. Они могут полимеризоваться при температуре 600 С.
Ультрамикротомия. С помощью стеклянных или алмазных ножей на ультрамикротомах изготавливаются очень тонкие срезы (500 А0).
Контрастирование. Для контрастирования используют тетраокись осмия, соли тяжелых металлов (урана, свинца), фосфорновольфрамовую кислоту, которые в строго определенных условиях дифференцированно могут окрашивать РНК, ДНК, полисахариды, клеточные мембраны.
14
Также применяют методы электронной гистохимии, авторадиографии, позволяющие судить о внутриклеточной топографии ферментов, биологически активных веществ, а также о процессах синтеза и обмена белков, углеводов, липидов.
Тема: «ВВОДНОЕ ЗАНЯТИЕ»
Место гистологии в программе высшего медицинского образования определяется, прежде всего, ее фундаментальным значением для медицины, а также связью с важнейшими философскими категориями: «содержание» и «форма» (структура и функция). Именно в этом аспекте рассматриваются стоящие перед современной гистологической наукой задачи изучения не только строения различных тканей и органов, но и их становления, изменения в процессе жизнедеятельности и при патологии. Именно на знаниях нормального строения клеток и тканей базируются нормальная и патологическая физиология, патологическая анатомия, биохимия и фармакология, токсикология и др.
Первое занятие знакомит студентов с наукой - гистологией, методами ее исследования, историей и перспективами развития, проблемами текущих лет. На данном занятии студенты должны: изучить технику изготовления гистологических препаратов для световой и электронной микроскопии, научиться микроскопировать гистологические препараты под световым микроскопом и пользоваться методическими пособиями. На этом занятии студенты также знакомятся с правилами поведения на кафедре гистологии и техникой безопасности.
Основные вопросы темы
1.Гистология, еѐ разделы.
2.История развития гистологии за рубежом и в России.
3.Известные отечественные школы гистологов: Московская, Петербургская, Казанская, Киевская. История кафедры гистологии Ростовского государственного медицинского университета.
4.Связь гистологии с теоретическими и клиническими дисциплинами.
5.История развития микроскопа, виды микроскопирования.
6.Световой микроскоп, его строение, принцип работы.
7.Основные этапы изготовления гистологических препаратов.
8.Правила микроскопирования гистологических препаратов.
9.Цито-, иммуноцито- и гистохимические методы исследования. Их значение.
10.Электронный микроскоп, его строение, принцип работы.
11.Особенности обработки объектов для электронной микроскопии.
12.Люминесцентная микроскопия и еѐ значение. Принцип устройства люминесцентного микроскопа.
13.Экспериментальные методы исследования в гистологии (метод культуры тканей, трансплантации, регенерации и др.)
14.Правила пользования методическими указаниями для практических занятий.
15.Правила поведения студентов на кафедре гистологи РостГМУ.
15
16. Правила техники безопасности на кафедре гистологии РостГМУ.
Цель занятия
В конце занятия студент должен уметь:
1.Дать определение науке гистологии и еѐ разделам.
2.Объяснить связь гистологии с другими медицинскими дисциплинами.
3.Кратко изложить историю кафедры гистологии РостГМУ.
4.Правильно изложить последовательность изготовления гистологических препаратов.
5.Правильно пользоваться световым микроскопом.
6.Микроскопировать гистологические препараты.
7.Кратко изложить суть применяемых в гистологии современных методов исследования (электронной гистохимии, авторадиографии, морфометрии, иммуноцитохимии и д.р.)
8.Объяснить основные положения правил техники безопасности на кафедре.
Самостоятельная работа студентов
Вид работы: обучение правилам работы со световым микроскопом, микроскопированию гистологических препаратов, правилам техники безопасности.
Программа работы и ориентировочные основы действия
1.Ознакомление с историей кафедры гистологии РостГМУ.
2.Ознакомление с организацией лекционного курса и практических занятий на кафедре.
3.Ознакомление с этапами изготовления гистологических препаратов.
4.Ознакомление с рабочими и служебными помещениями кафедры.
5.Изучение правил работы со светооптическим микроскопом.
6.Изучение правил микроскопирования гистологических препаратов.
7.Изучение правил техники безопасности.
8.Просмотр демонстрационных гистологических препаратов.
Правила работы с микроскопом на практических занятиях
1.Замкнуть револьвер микроскопа на засечку объектива малого увеличения
(8х).
2.Осветить поле зрения с помощью вогнутой стороны зеркала.
3.Поместить препарат на предметный столик микроскопа покровным стеклом
вверх.
4.Вращением макрометрического винта установить препарат в фокусе малого увеличения и, рассмотрев его, установить место, необходимое для изучения, в центре поля зрения.
16
5.Повернуть плавно револьвер на объектив большого увеличения с обязательным замыканием засечки револьвера.
6.Осторожным вращением макрометрического винта (обычно приподнимая тубус) установить фокус данного увеличения и, вращая микрометрический винт, просмотреть препарат на его различной глубине.
7.Перемещение препарата осуществлять вращением винта предметного стола. Рассмотрев препарат, приступить к зарисовке.
8.Улучшение степени контрастности препарата достигается перемещением конденсора.
9.Закончив работу с препаратом, необходимо поднять тубус, перевести револьвер на малое увеличение, а затем снять препарат с предметного столика.
Правила микроскопирования гистологических препаратов
1.Установить микроскоп на рабочем месте напротив источника освещения.
2.Перевести револьвер на объектив малого увеличения (х 8).
3.Вращая винт поднять конденсор вверх почти до упора.
4.Навести вогнутым зеркалом свет, обеспечивая равномерное освещение поля зрения в микроскопе.
5.Положить предметное стекло (препарат) покровным стеклом вверх на предметный столик.
6.Макровинтом расположить объектив малого увеличения на расстоянии до 1 сантиметра от поверхности предметного столика.
7.Перемещая препарат увидеть в поле зрения окуляра контуры препарата.
8.Вращая макровинт, получить оптимально чѐткое изображение препарата.
9.Изучить описание данного препарата в методическом пособии к
практическим занятиям.
10.Перемещая препарат изучить указанные детали препарата. 11.Поставить необходимую деталь препарата в центр поля зрения. 12.Не меняя фокусировки, перевести револьвер микроскопа на большое
увеличение.
13.Увидев контуры препарата и осторожно вращая микровинт, получить чѐткое изображение структур.
14.При необходимости переместить нужную структуру в центр поля зрения. 15.Закончив изучение препарата, перевести микроскоп на малое увеличение
и убрать препарат с предметного столика.
16.Гистологические препараты для изучения всегда должны находиться на рабочем столе рядом с микроскопом покровным стеклом вверх.
Правила техники безопасности (для студентов) на кафедре
При проведении лабораторных работ на кафедре гистологии студенты получают в своѐ распоряжение световые микроскопы и гистологические препараты. Процесс микроскопирования этих препаратов связан с использованием электрического освещения. Поэтому, основными требованиями правил безо-
17
пасности во время проведения лабораторных работ являются: осторожность в работе с микроскопом и электрическим освещением, продуманность совершаемых действий.
Основные правила во время микроскопирования гистологических препаратов:
1.Во время занятий студент должен находиться на отведенном ему рабочем месте.
2.Перед работой со световым микроскопом убедиться в его исправности.
3.В процессе микроскопирования гистологических препаратов убедиться в их целостности.
4.Соблюдать правила микроскопирования гистологических препаратов.
5.Включая лампы освещения микроскопов убедиться:
-в исправности самой лампы и еѐ изоляции,
-в исправности электрической вилки и розетки,
-в целости изоляции проводов.
6.Все вопросы по качеству работы микроскопа, ламп освещения и о состоянии гистологических препаратов разбирать только с преподавателем.
Демонстрационные препараты
1.Окраска гематоксилином-эозином. Печень аксолотля. Обзорный препарат.
2.Окраска кармином по способу Беста. Выявление гликогена.
3.Окраска жира суданом III.
4.Окраска жира красным Шарлахом.
5.Реакция Фельгена. Выявление ДНК.
6.Реакция Браше. Выявление РНК.
7.Окраска муцикармином. Выявление слизи.
8.Окраска железным гематоксилином. Выявление поперечной исчерченности мышечной ткани.
9.Импрегнация азотнокислым серебром. Выявление нервных клеток.
10.Окраска метиленовой синью. Выявление нервных клеток. 11.Окраска резорцин-фуксином. Выявление эластических волокон.
Подведение итогов занятия (контроль)
Опрос по изученным правилам работы с микроскопом, правилам микроскопирования препаратов, правилам техники безопасности.
Задание для самоподготовки к следующему занятию: смотреть основные вопросы по теме следующего занятия.
Примечание. Электронные микрофотографии всего курса цитологии, общей гистологии и частной гистологии находятся в специальном руководстве по изучению строения клеток на ультрамикроскопическом уровне. Данное руководство в достаточном количестве для проведения лабораторных исследований.
18
Тема: «ЦИТОЛОГИЯ (биология клетки)»
Цитология – наука, занимающаяся изучением строения, функционирования, происхождения (развития) различных типов клеток, а также их реактивных состояний и гибели. В современном понятии о клетке, как основной единице живого, рассматриваются не только клеточный и внутриклеточный, но и надмолекулярный и молекулярный уровни организации живой материи, знание которых способствует морфологическому обоснованию: физиологических процессов на клеточном уровне; структурно-функциональных особенностей неклеточных структур, становления полидифферонной организации тканей и органов. Знания морфофункциональных характеристик различных клеток, а также структур, входящих в их состав, необходимы студентам при изучении разделов общей и частной гистологии.
Материал этой темы является основой для изучения нормальной физиологии, патологической анатомии и физиологии, фармакологии, гематологии.
Основные вопросы темы
1.Общий принцип организации эукариотической клетки.
2.Общий принцип строения клеточной оболочки – плазмолеммы.
3.Строение биологической мембраны. Жидкостно-мозаичная модель мембраны.
4.Свойства мембраны, обусловленные наличием «липидного бислоя».
5.Свойства мембраны, обусловленные наличием белков; биологическая роль белков.
6.Строение и роль гликокаликса.
7.Строение и роль субмембранного комплекса – кортикального слоя.
8.Мембранный транспорт: пассивный, активный, облегченный.
9.Эндоцитоз, его разновидности.
10.Строение и роль окаймленных ямок и пузырьков.
11.Понятие об экзоцитозе и трансцитозе.
12.Понятие о мембранных рецепторах и выполняемые ими функции.
13.Межклеточные соединения – механические: интердигитации, десмосомы, промежуточные соединения, плотные соединения.
14.Межклеточные - коммуникационные соединения: щелевые, синапсы.
15.Цитоплазма, компоненты еѐ составляющие.
16.Понятие о гиалоплазме.
17.Строение и значение гранулярной эндоплазматической сети.
18.Строение и значение агранулярной эндоплазматической сети.
19.Строение и значение комплекса Гольджи.
20.Строение и значение митохондрий.
21.Строение и значение лизосом.
22.Типы лизосом.
23.Строение и значение пероксисом.
24.Строение и значение рибосом.
25.Цитоскелет клетки, его структурные элементы и их производные.
26.Строение и значение клеточного центра.
19