Генетика и МГК. Ситуационные задачи с решением

Кариотипирование.

Лучшим способом диагностики болезни остается кариотипирование. Оно предусматривает анализ хромосомного набора пациентки с установлением наличия дополнительной X-хромосомы. Для определения кариотипа используют как прямые, так и

непрямые методы исследования. В первом случае материал, взятый из костного мозга, лимфатических узлов или других тканей, изучают сразу же после получения. Однако прямой метод информативен только тогда, когда в материале имеется достаточное количество метафаз митоза, так как только в этой фазе хромосомы приобретают присущие им особенности строения и возможна их точная идентификация.

FISH-диагностика.

Задача №13

В ККМГ направлен детским неврологом ребёнок с целью уточнения диагноза. У неё периодически отмечались эпилептические припадки. Из данных анамнеза стало известно, что ребёнок (девочка) единственная, родилась недоношенной.

Родители: супруге 34 года; супругу 39 лет; здоровы. В акушерском анамнезе матери ребёнка двое мёртворождённых дочерей. Кариотипы родителей в норме.

Её родители, сестра и брат здоровы, имеют по одному здоровому ребёнку. Родители супруга здоровы; брат здоров и имеет троих здоровых сыновей.

При осмотре ребёнка обнаружено:

адинамия, гипотрофия мышц, судорожное сокращение мышц; задержка психофизического развития; нарушение слуха зрения.

Биохимический анализ: в крови обнаружен высокий уровень содержания молочной кислоты; уменьшение концентрации кальция.

Биопсия мышц: обнаружен феномен «рваных красных волокон» (разрывы миофибрилл)

1 этап - уточнение диагноза

При осмотре ребёнка обнаружено:

адинамия, гипотрофия мышц, судорожное сокращение мышц; задержка психофизического развития; нарушение слуха зрения.

Биохимический анализ: в крови обнаружен высокий уровень содержания молочной кислоты; уменьшение концентрации кальция.

Биопсия мышц: обнаружен феномен «рваных красных волокон» (разрывы миофибрилл)

Родословная

Исходя из выше перечисленных данных, можно сделать вывод, что ребенок страдает синдромом MELAS - Mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes — «митохондриальная энцефаломиопатия, лактатацидоз, инсультоподобные эпизоды».

Основными клиническими критериями диагноза MELAS являются:

•материнский тип наследования; начало до 40 лет;

•нормальное психомоторное развитие до заболевания;

•непереносимость физических нагрузок;

•мигренеподобная головная боль с тошнотой и рвотой; инсультоподобные эпизоды;

•энцефалопатия с эпилептическими приступами и/или деменцией;

•лактат-ацидоз;

•рваные красные волокна в биоптатах скелетных мышц;

•прогрессирующее течение.

2 этап - прогноз потомства

Большая часть детей пациентки будет страдать данным заболеванием, так как синдром MELAS передается от матери всем детям с яйцеклеткой, которая содержит мутантные митохондрии. Дети могут иметь разную выраженность симптомов.

В процессе формирования первичных половых клеток серия последовательных делений приводит к тому, что в образовавшихся клетках соотношение митохондрий с мутантной и нормальной мтДНК будет существенно отличаться от их соотношения в исходной (материнской) клетке, т. е. будет наблюдаться иной уровень гетероплазмии - состояние, при котором в цитоплазме клетки сосуществуют митохондрии с двумя разными вариантами мтДНК (нормальной и мутантной), в отличие от гомоплазмии, при которой мтДНК всех митохондрий клетки представлена одним типом (мутантным или нормальным)

3 этап - заключение и подтверждение диагноза

Заключение : вероятность передачи заболевания потомкам будет зависеть от того, какие митохондрии будут содержаться в яйцеклетке, участвующей в оплодотворении. Выраженность симптомов у больных детей колеблется от легкой до тяжелой формы. Пожтверждение диагноза:

Молекулярно-генетический анализ

1. Получение образцов ДНК:

—выделение митохондриальной ДНК

—рестрикция ДНК — получение отдельных фрагментов ДНК (использование рестриктаз, которые разрывают ДНК по строго определенным последовательностям нуклеотидов из 4-6 пар оснований — сайтах рестрикции).

2. Амплификация — накопление (умножение, клонирование) одинаковых фрагментов ДНК:

—использование классических трудоемких методов: создание рекомбинантных плазмид —> введение их в бактериальную клетку —> размножение клеток —> выделение заданных фрагментов ДНК;

— использование полимеразной цепной реакции: разделение двухцепочечной ДНК на одноцепочечную —> присоединение праймеров (затравка) к одноцепочечным молекулам ДНК (по принципу комплементарности) —> синтез многочисленных полинуклеотидных цепей на одноцепочечных молекулах в границах присоединения праймеров.

3.Электрофорез фрагментов ДНК — разделение фрагментов по молекулярной массе и электрическому заряду на поверхности агарозного геля. Каждый фрагмент имеет определенные размеры и занимает в геле определенное место в виде дискретной полосы.

4.Идентификация конкретных фрагментов ДНК с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Фрагменты ДНК переносятся на специальные фильтры, где проводится их гибридизация с радиоактивными синтетическими зондами или клонированными фрагментами ДНК. Зонд выявляет необходимый фрагмент ДНК путем связывания с комплементарными ему нуклеотидными последова-тельностями фрагмента.

Изменение положения и длины фрагмента по сравнению с контролем (зондом), исчезновение или появление нового фрагмента свидетельствует о перестройках последовательности нуклеотидов в исследуемом гене.

Для пренатальной диагностики используется исследование уровня лактата-пирувата в амниотический жидкости, для чего проводится амниоцентез - инвазивная процедура, заключающаяся в пункции амниотической оболочки с целью получения околоплодных вод для последующего лабораторного исследования.

2 этап - прогноз потомства

Муковисцидоз имеет аутосомно-рецессивный тип наследования.В России в среднем частота болезни 1:10000 новорождённых. По условиям задачи супруги являются полусибсами - сводными братом и сестрой, что повышает риск передачи заболевания потомству.

В целях ранней диагностики муковисцидоз входит в программу обследования новорождённых на наследственные и врождённые заболевания. Исследуют уровень иммунореактивного трипсина в сухом пятне крови. При положительном результате тест повторяют на 21—28 день жизни. При повторном положительном результате назначают потовый тест.

3 этап - заключение и подтверждение диагноза

Заключение: у ребенка диагнозтирован муковисцидоз Методы подтверждения диагноза :

Метод FISHфлуоресцентная гибридизация IN SITU - включает следующие этапы:

-создание зондов - однонитевых фрагментов ДНК, к которым присоединяют биотин или дигоксигенин;

-щелочная обработка препаратов IN SITU с целью денатурации хромосомной ДНК за счет

разрыва водородных связей между двумя цепями ДНК;

-гибридизация хромосомной ДНК сзондом путем комплементарного связывания зонда со специфической последовательностью хромосомы;

-обработка препаратов веществами, которые избирательно связываются с биотином и дигоксегенином; для биотина таким веществом является стрептовидин, для дигоксегенина - антидигоксигениновое антитело;

-визуализация хромосом спомощью люминесцентного микроскопа на фоне неокрашенных хромосом.

Пренатальная диагностика: исследование изоэнзимов тонкокишечной щелочной фосфатазы из околоплодных вод, возможно с 18—20 недели беременности. Ложноположительные и ложноотрицательные значения получают в 4 % случаев. (амниоцентез)

1 курс ЛПФ, 4А группа,Хачатрян Елена

Данные задачи

1)Первый этап-уточнение диагноза

Клинический осмотр

Исходя из данных осмотра:низкий рост, брахицефалия, прогнатия, на шее крыловидные кожные складки, короткая шея с низкой линией роста волос на затылке, грудная клетка широкая, щитовидная, широко расставленные соски, сандалевидная стопа, инфантильность.Можно сделать вывод-у пациентки синдром Шерешевского-Тернера