книги / 829

УДК 632.95+543.544.2

Г.А. Козлова, Е.В. Пименова, А.В. Кожева*

Пермский государственный технический университет, *Пермская государственная сельскохозяйственная академия

МИКРОБНАЯ ДЕГРАДАЦИЯ ГЕРБИЦИДА «ТРЕЗОР» НА ОСНОВЕ 2,4-ДИХЛОРФЕНОКСИУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ

Исследована способность ряда штаммов бактерий к биодеструкции гербицида на основе 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. Проведена оценка возможности обнаружения остаточных количеств пестицида в культуральной жидкости методом высокоэффективной жидкостной храмотографии.

В настоящее время существует реальная проблема накопления остаточных количеств пестицидов в окружающей среде. Они могут накапливаться в воде, донных отложениях, почве, мигрировать по цепям питания, концентрируясь в живых организмах.

Один из самых известных и широко используемых в последние 50 лет антиауксинов (гербицидов) – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) [1]. 2,4-Д обладает свойством регулировать рост растений, используется как гербицид для борьбы с сорняками некоторых зерновых культур, относится ко второму классу опасности. Персистентность вещества в почве и донных отложениях зависит от сложного комплекса условий и колеблется от нескольких дней до нескольких лет. 2,4-Д – среднетоксичное соединение, однако токсичность промышленных препаратов значительно повышается за счет возможного присутствия в их составе примесей диоксинов. В настоящее время применяются технологии, исключающие образование этих суперэкотоксикантов.

Микроорганизмы играют основную роль в разложении 2,4-Д при условии, что вещество гомогенно распределено в жидкой фазе почвы, не связано с ее органо-минеральными коллоидами и не оказывает влияния на активную почвенную микрофлору [2].

Деградация 2,4-Д может осуществляться многими микроорганиз-

мами: бактериями рода Rhizobium, Corinebacterium, Agrobacterium, Arthobacter, Achromobacter, Flavobacterium, Pseudomonas, а также акти-

61

номицетами и грибами: Nocardia, Penicillium, Aspergillus. Кроме того, об-

наружены некоторые штаммы бактерий, содержащих специфические по 2,4-Д плазмиды, передающиеся от одной клетки к другой и тем самым переносящие генетическую способность бактерий разлагать 2,4-Д [3, 4].

Процесс разложения 2,4-Д микроорганизмами происходит различными путями. Из продуктов разложения, сохранивших бензольное кольцо, выделены 2,4-дихлорфенол, 3,5-дихлорпирокатехин, 3-хлорпи- рокатехин, 4-хлорпирокатехин.

По оценке различных авторов, на 50–70 % процессы деградации осуществляются под действием микроорганизмов. В то же время частота встречаемости отдельных штаммов-деструкторов в почве невелика. Замечено, что многократное применение пестицидов приводит к изменению микробного ценоза почвы в сторону возрастания в ней относительной доли микроорганизмов, способных разлагать эти ксенобиотики.

При обнаружении значительного загрязнения почвы 2,4-Д необходимо вмешательство человека в процессы естественного самоочищения почв. Детоксикацию почв, загрязненных гербицидами, проводят с помощью адсорбционных и микробиологических способов очистки. Микробиологический способ предусматривает применение микробных препаратов для детоксикации повышенных концентраций гербицидов на ограниченной площади: на очистных сооружениях, в пунктах хранения и т.п.

Для определения 2,4-Д в воде органами Ростехнадзора используется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Данный метод является очень производительным, не требует экстракции пестицидов органическими растворителями при анализе воды и других водосодержащих объектов. Метод избирателен в присутствии глобальных загрязнителей окружающей среды – производных циклопарафинов (ГХЦГ и его изомеры), соединений дифенилметанового ряда (ДДТ и его производные), а также галакона, глифосата и других гербицидов, применяемых на зерновых культурах [5].

Целью наших исследований было изучение способности некоторых штаммов микроорганизмов утилизировать остаточные количества ряда комплексных гербицидов на основе 2,4-Д и оценка возможности определения действующего вещества (д. в.) гербицида в культуральной жидкости методом ВЭЖХ для контроля за протекающими процессами.

62

Был проведен скрининг 12 штаммов почвенных микроорганизмов из лабораторной коллекции после их длительного хранения под слоем вазелинового масла. Штаммы были выделены из почвенных образцов, отобранных с полей учхоза «Липовая гора», подвергавшихся обработке гербицидами на основе 2,4-Д [6].

Способность различных культур бактерий к росту на среде с исследуемым субстратом изучали на синтетической минеральной среде следующего состава (г/л): (NH4)2SO4 – 1,0; NaCl – 1,0; MgSO4 – 0,2; Na2CO3 – 0,2; Na2HPO4 – 0,16; KH2PO4– 0,04, раствор микроэлементов по Хогланду – 1 мл, рН 7,2–7,4, следовые количества дрожжевого экстракта.

В среду в качестве единственного источника углерода добавляли исследуемый пестицид «Трезор» (использовали коммерческий препарат Tresor 60 WP) с концентрацией 0,1 % по д. в.

Инокулят выращивали на аналогичной среде при температуре 30 °С, без аэрации. Засев проводили в пробирки в соотношении инокулята и среды 1:20. Культивирование осуществляли в термостате в аналогичных условиях.

О росте культуры судили по косвенному показателю численности бактерий – оптической плотности культуральной жидкости. Жизнеспособность клеток определяли методом посева петлей на плотную синтетическую среду с гербицидом. Учет численности бактерий проводили методом 10-кратных разведений с последующим высевом на мясопептонный агар. Все методы, используемые в экспериментальных исследованиях, описаны в работе [7]. Результаты первичного отбора штаммов представлены в табл. 1.

Таблица 1

Оптическая плотность (ОП) культуральной жидкости через сутки роста различных культур

63

Можо видеть, что наиболее активный рост суточных культур через сутки роста отмечен у штаммов № 3, 7, 9, 11.

Параллельно проводили проверку жизнеспособности клеток высевом петлей на чашки Петри и культивировали при тех же условиях на среде с «Трезором» (табл. 2).

Таблица 2

Рост бактерий на плотной синтетической среде с пестицидом «Трезор»

Примечание: ++ хороший рост, + слабый рост, – нет роста.

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что большинство штаммов сохранило жизнеспособность после длительного хранения, в то же время штаммы № 2, 10 и 12 не проявили способность к росту.

После суммирования данных по величине оптической плотности и способности к росту для дальнейших исследований были выбраны 3 штамма почвенных микроорганизмов: № 3, 7 и 8.

Для оценки способности микроорганизмов использовать 2,4-Д был проведен анализ культуральной жидкости. Культивирование осуществляли в при тех же условиях в термостате при 30 ºС и атмосферном давлении в течение 7 сут. Пробы культуральной жидкости отбирали через определенное время, фильтровали через мембранный фильтр, центрифугировали в течение 15 мин при 5000 об/мин.

Анализ проводили на жидкостном хроматографе «Милихром 5». Первоначально была показана возможность применения для проведения анализа пестицида в водных растворах колонки «Диасорб-130 С16» вместо предложенной в стандартной методике колонки с неподвижной фазой «Силасорб С18», для чего провели определение 2,4-Д в стандартном растворе с концентрацией 0,1 мг/мл (чистота кислоты 99,8 %). Ус-

64

ловия хроматографирования: подвижная фаза вода:метанол (7:3), скорость элюирующего потока 200 мкл/мин, объем удерживания 235 мкл. Детектирование проводилось при длине волны 280 нм. Количественное определение в анализируемых пробах проводили методом внешнего стандарта и методом абсолютной калибровки. Время удерживания пика 2,4-Д составило 1,503 мин.

Анализ культуральной жидкости проводили по описанной выше методике, объем пробы 10 мкл.

Динамика биодеструкции пестицида по остаточному количеству действующего вещества различными штаммами приведена в табл. 3.

Через 6 ч роста культур во всех пробах наблюдалось присутствие узкого пика 2,4-Д, причем площади всех пиков уменьшились. Наиболее интенсивный рост наблюдался у штамма № 3.

Таблица 3 Остаточные количества 2,4-Д в культуральной жидкости, мкг/10 мкл

Начиная с анализов проб, отобранных через 12 ч, площади данных пиков начали увеличиваться. При детальном рассмотрении хроматограмм было отмечено, что на пик 2,4-Д накладывается пик-наездник, соответствующий другому веществу. В исследуемых условиях разделение данных пиков полностью не было достигнуто из-за близкого времени удерживания, поэтому они считаются программой за один широкий пик с большим основанием, поэтому площадь пика возрастает и даже превышает исходную. Изменение соответствующих параметров обработки пиков при расчетах параметров хроматограммы позволяет доказать наличие пиков двух веществ.

Время выхода у нового вещества (1,584 мин) больше, чем у 2,4-Д (1,503 мин), что позволяет предположить наличие в нем большего количества полярных групп. Исходя из литературных данных о составе продуктов деструкции 2,4-Д это вещество может относиться к классу фенолов.

Таким образом, данная методика может применяться для определения остаточных количеств гербицида в культуральной жидкости

65

УДК 628.3

М.В. Плетнёва, Е.А. Фарберова, А.В. Виноградова

Пермский государственный технический университет

БИОСОРБЦИЯИОНОВМЕДИ(II) ИЗВОДНЫХРАСТВОРОВ

В ходе проведенных экспериментов было выявлено, что биомасса выделенных слизеобразующих микроорганизмов способна поглощать ионы меди (II) из растворов. Однако степень извлечения ионов меди (II) составляет не более 44 %. Увеличить ее удалось путем иммобилизации клеток слизеобразующих микроорганизмов на поверхность твердого носителя, в качестве которого был выбран активный уголь марки БАУ.

Полученный биосорбент способен эффективно поглощать ионы меди из модельного раствора, обеспечивая при этом их максимальную степень извлечения (98,6 %). Наиболее интенсивно процесс идет в течение первых трех часов.

Одним из источников загрязнения водоемов, приводящих к ухудшению качества воды и нарушающих условия обитания в них гидробионтов, являются сточные воды заводов, содержащие разбавленные растворы тяжелых металлов. Состав их чрезвычайно разнообразен, он изменяется в процессе появления новых производств и усовершенствования существующих. В сточных водах предприятий металлургической, машиностроительной, приборостроительной, автомобильной

идругих отраслей промышленности содержится значительное количество загрязняющих веществ, в состав которых входят ионы металлов:

Сr(VI), Fе(III), Zn(II), Cu(II), Ni(II), А1(III), а также различные органи-

ческие вещества – спирты, кислоты, поверхностно-активные вещества

инефтепродукты [1].

Тяжелые металлы в природных водах находятся в растворенном и адсорбированном состоянии. Попадая в воду в ионной форме, они накапливаются в осадках в виде гидрооксидов, карбонатов, сульфидов или фосфатов. Содержание различных металлов в водоемах варьирует в широких пределах.

Вопросам очистки сточных вод от различных вредных примесей посвящено много исследований. Проводимая в настоящее время очистка стоков от тяжелых металлов химическими, физическими, элек-

67

трохимическими способами дорога, громоздка, причем не всегда обеспечивается высокая степень их извлечения. Достигнуты крупные успехи по разработке и внедрению способов биологической очистки бытовых и ряда других сточных вод. В то же время, несмотря на то, что микробиологическая трансформация и детоксикация отдельных металлов и их соединений уже достаточно полно изучена, биологическая очистка от них промышленных сточных вод находится на стадии разработки и становления [2].

Перспективны микробиологические методы сорбции и осаждения ионов металлов. Для извлечения металлов из растворов могут быть использованы представители различных таксономических групп. Так, клетки Tiobacilus ferroxidans извлекают из раствора ионы Cd (II),

Co(II), Cu(II), Cr(II), Fe(II), Ni(II), Ag+, Au(III); Rhodotorula mucilagi-

nosa – Cd(II), Co(II), Cu(II), Ni(II), Zn (II).

Адсорбция положительно связанных металлов на поверхности клеток, как полагают авторы, связана с присутствием отрицательно заряженных групп анионов: РО43-, СОО-, НS-, ОН- в биополимерах,

иобусловлена механизмом комплексообразования. Некоторые микроорганизмы синтезируют химические соединения, обладающие высоким сродством к отдельным металлам, в частности, полисахариды. Они содержат остатки сахаров, органические кислоты, аминосахара, ацильные производные и другие соединения, которые способны образовывать комплексы с катионами тяжелых металлов [3].

Это дает основание предположить, что некоторые группы микроорганизмов могут использоваться в качестве биосорбентов для связывания ионов меди.

Сцелью проверки выдвинутого предположения были выделены

иописаны микроорганизмы, способные к слизеобразованию.

Изучено влияние присутствия ионов меди на интенсивность роста выделенных микроорганизмов. Для этого культуру слизеобразующих микроорганизмов засевали в чистую среду МПБ и эту же среду

сдобавлением Сu2+ в количестве 50 мг/л. Культивирование проводили при 30 °С на встряхивателе (160–170 об/мин). Прирост биомассы оценивали по изменению оптической плотности культуральной жидкости

споследующим построением кривых роста (рис. 1).

Как видно из представленного графика, присутствие ионов меди (II) в питательной среде не влияет на длительность фаз роста микроорганизмов, но вэкспоненциальной фазе снижается удельная скорость роста.

68

В связи с тем, что рН поверхности активного угля БАУ находится в пределах 8–10, а водные растворы солей меди (II) имеют слабокислую реакцию среды, было изучено влияние рН среды на интенсивность роста микроорганизмов (рис. 2).

Рис. 2. Кривые роста культуры выделенных микроорганизмов при разных значениях рН среды:

Показано, что наибольшее накопление биомассы в стационарной фазе наблюдается при нейтральной (рН 6) и слабощелочной (рН 8) реакции среды. При рН 6 в среде не наблюдается ярковыраженной лагфазы. В слабокислой среде (рН 4) лаг-фаза составляет 5 ч, т.е. наблюдается лимитирование роста культуры.

С учетом результатов проведенных исследований был создан биосорбент на основе активного угля с иммобилизованными на его поверхность клетками слизеобразующих микроорганизмов.

Иммобилизацию клеток на твердый пористый носитель проводили путем обработки образца активного угля суспензией микроорганизмов по коэффициенту пропитки.

Образец биосорбента в количестве 10 г помещали в колбу, куда заливали 200 мл модельного раствора с концентрацией ионов меди (II) 50 мг/дм. Рабочий раствор отделяли от биосорбента путем фильтрования. Остаточные концентрации ионов меди (II) в полученных пробах раствора замеряли методом атомно-адсорбционной спектрометрии. Результаты экспериментов приведены в таблице.

70