книги / 829

Анализ полученной зависимости позволил выявить фазы роста культуры (см. рис. 3): 1 – лаг-период; 2 – экспоненциальная фаза роста; 3 – фаза замедления роста; 4 – стационарная фаза. Максимальная скорость роста µmax равна отношению ∆lnD/∆τ для полулогарифмической зависимости в экспоненциальной фазе роста. Получено значение µmax =

Было обнаружено, что рН среды изменяется в ходе процесса культивирования (рис. 4).

Рис. 4. Зависимость рН среды от времени культивирования

Характер изменения рН среды в зависимости от времени культивирования можно объяснить на основе представлений о двухфазном метаболизме [15]. Продукт брожения на первой фазе – более окисленные органические вещества, а на второй – более восстановленные, что согласуется с приведенной выше схемой процесса (см. рис. 2). За счет размножения и увеличения численности микроорганизмов первоначально нейтральная среда подкисляется (образуется уксусная и другие кислоты). Далее микроорганизмы начинают функционировать так, как им свойственно при пониженных рН, и можно ожидать образование спиртов.

Анализ продуктов брожения газохроматографическим методом показал, что основным продуктом может быть как бутанол, так и этанол (рис. 5).

При этом в строго анаэробных условиях, когда среда проявляет восстановительные свойства, основным продуктом брожения становится бутанол (время удержания 11,1 мин), а при неполном соблюде-

31

нии условия анаэробности – этанол (время удержания 6,7 мин). Также интересующие нас продукты: ацетон (время удержания 5,6 мин) и масляная кислота (время удержания 18,2 мин).

Рис. 5. Хроматограммы культуральной среды: а – строгие анаэробные условия;

б– неполное соблюдение анаэробных условий

Сучетом результатов проведенного исследования и литературных данных [10] можно сформулировать условия, способствующие наибольшему выходу бутанола, как продукта расщепления глюкозы

ванаэробных условиях:

1)строгое соблюдение условий анаэробности;

2)высокая концентрация кислот во внеклеточной среде, пониженное значение рН;

3)высокая концентрация глюкозы;

4)пониженная концентрация продуктов процесса брожения за счет их выведения из культуральной жидкости.

32

В текущем десятилетии интенсифицируются исследования по получению бутанола из различных видов сырья и отходов производства, компонентами которых являются не только гексозаны (С6), но и пентозаны (С5) [7,16].

Список литературы

1.Henderson K. Biofuels – growing energy solutions for the transport sector // Energy world. 2007. №4. P. 10.

2.Archer G. Delivering sustainable Biofuels // Energy world. 2007.

№4. P.13.

3.Бражинский О.Б. Альтернативные моторные топлива: мировые тенденции и выбор для России // Рос. хим. журн. 2008. №6. С. 137–146.

4.Карпов С.А., Борзаев Б.Х. Исследование высокооктановых спирто-бензиновых композиций с добавками алкилфенолов // Нефтепереработка и нефтехимия. 2008. №2. С. 29–34.

5.Wackett L.P. Biomass to fuels via microbial transformations // Current Option in Chemical Biology. 2008. V. 12. P. 187–193.

6.Microbiology of synthesis gas fermentation for biofuel production / A.M. Henstra [et al.] // Current Option in Chemical Biology. 2007. V. 18. P. 200–206.

7.Ezeji T.C., Qureshi N., Blascheck H.P. Bioproduction of butanol from biomass: from genes to bioreactors // Current Option in Chemical Bi-

ology. 2007. V. 8. P. 220–227.

8.Практикум по микробиологии / А. И. Нетрусов [и др.]. М.:

Академия, 2005. 608 с.

9.Егоров Н.С. Практикум по микробиологии. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1995. 224 с.

10.Karakashev D., Thomsen A.B., Angelidaki I. Anaerobic biotechnological approaches for production of liquid energy carriers from biomass

//Biotechnol. Lett. 2007. V. 29, P. 1005–1012.

11.Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1987. 303 с.

12.ГОСТ Р 51786–2001. Водка и спирт этиловый из пищевого сырья. Газохроматографический метод определения подлинности.

13.Utilization of biomass for the supply of energy carriers / P.A.M.

Claassen [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 52. P. 741–755. 14. Тюкавкина Н.А., Бауков Ю.И. Биоорганическая химия. М.:

Дрофа, 2005. 542 с.

33

УДК 579.6:631.46.504

И.С. Боровкова, В.В. Вольхин

Пермский государственный технический университет

ПОЛУЧЕНИЕ БИОПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ АБОРИГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ-НЕФТЕДЕСТРУКТОРОВ

Определены условия активации аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов, отобранных с образцами почвы на участке земли, загрязненной нефтью. Приготовлен жидкий «биопрепарат», внесение которого в почву в количестве 9·108 кл./г приводит к увеличению степени биодеградации нефти с 25,4 (контроль) до 79,1 % в течение 13 недель.

Загрязнение окружающей среды нефтью и нефтепродуктами продолжается, несмотря на совершенствование технологий нефтедобычи, нефтепереработки и трубопроводных транспортных систем. По оценкам специалистов [1, 2], суммарные потери нефти достигают 3 % ее годовой добычи. При современных масштабах потребления нефти эти потери выходят на уровень 6–9 млн т. В результате аварийных разливов нефти особенно страдают почва и поверхностные воды. Нарушается нормальное функционирование природных экосистем. Поэтому возникает проблема ремедиации загрязненной среды. В данной работе ограничимся рассмотрением проблемы ремедиации нефтезагрязненной почвы.

Решению проблемы восстановления нефтезагрязненной почвы и, прежде всего, разработке методов биоремедиации посвящено много работ [1–8]. Исследования проводятся в основном в двух направлениях: стимуляция естественной нефтеокисляющей микрофлоры непосредственно на участке почвы, подвергнувшейся загрязнению нефтью или нефтепродуктами, и интродукция активных углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ) в почву, пострадавшую от нефтезагрязнения. В последнем случае для интродукции используют биопрепараты, включающие в себя активированные микроорганизмы и определенные добавки, повышающие эффективность утилизации углеводородов. Второе из указанных направлений биоремедиации почвы особенно оправдано для зон умеренных и приполярных регионов, где из-за длительного периода сохранения низких температур почвы ее биоремедиация без применения интродукции микроорганизмов может растянуться на многие годы [6].

35

К настоящему времени разработан целый ряд препаратов: «Путидойл», «Деворойл», «Унирем», «Дестройл», «Petrobac-1», «Олеворин», «Экойл», «Экосорб», «КНОП» и др. [8]. Они показали свою эффективность в тех или иных регионах России. Но накопленный опыт показывает, что вряд ли возможно создать универсальный биопрепарат, который мог бы эффективно работать в разных почвенноклиматических зонах и в условиях функционирования различных по своей природе экосистем. Результаты зависят от составов аборигенной почвенной микрофлоры и нефти, вызвавшей загрязнение [8]. Поэтому разработчики биопрепаратов все чаще стремятся отобрать для активации аборигенную микрофлору непосредственно из почвы, подвергнувшейся нефтезагрязнению [4, 9, 10].

Задача данной работы – биодеградация нефти того типа, который перерабатывается на ООО «ЛУКОЙЛ-Пермнефтеоргсинтез», и использование в процессе биодеградации активированной аборигенной микрофлоры. В ходе эксперимента необходимо было определить условия получения активированной обогащенной культуры нефтеокисляющих микроорганизмов.

Методики исследования. Для подготовки жидкой обогащенной культуры использовали методику, принятую в работе [9]. Образцы нефтезагрязненной почвы (10 г), содержащей аборигенные микроорганизмы, культивировали в течение 17 сут в 100 мл нестерильной водопроводной воды в условиях постоянной аэрации на качалке (160 об/мин) при комнатной температуре. Для активации аборигенной почвенной микрофлоры в жидкую среду вносили (г/л): нитроаммофоску – 2,0, NaH2PO4 – 5,0 и K2HPO4 – 3,0. В качестве источника углерода и фактора селекции микроорганизмов служила сырая нефть – 5,0 г/л. В роли эмульгатора выступал синтанол – 0,02 г/л (синтанол – неионогенное поверхностно-активное вещество). Каждый вариант эксперимента был представлен в трех повторностях. Все добавки стерилизовались автоклавированием (1 изб. атм в течение 30 мин). Методика рассчитана на получение накопительной нефтеокисляющей культуры.

В обогащенной культуре проводили подсчет количества УОМ. Для этого осуществляли высевы из обогащенных культур (в трех повторностях) на чашки Петри с агаризованной средой следующего состава (г/л): KNO3 – 1; K2HPO4·3H2O – 0,262; MgSО4 – 0,2; CaCl2·2H2O – 0,2. В среду вносили также микроэлементы – 1 мл/л. Подсчет колоний производили через 12–14 сут. Общее число гетеротрофных микроорганизмов в исходныхобразцах определяли, используя общепринятый метод [11].

36

Содержание остаточных нефтепродуктов в почве определяли методом прямой экстракции (хлороформом) с весовым окончанием. Минимальная определяемая концентрация – 0,3 мг/кг. Относительное стандартное отклонение при концентрациях 0,3–1 мг/кг составляет 12 %, при концентрациях нефти 1–5 мг/кг – 5 %.

Статистическая обработка экспериментальных данных была проведена по методу Стьюдента: при n = 3 коэффициент Стьюдента tα = 4,3.

Результаты и их обсуждение. В начале работы важно было подтвердить, что отобранные образцы почвы содержат эффективные УОМ. Для оценки нефтеокисляющей способности микроорганизмов, содержащихся в образцах почвы, на их основе выращивали культуру УОМ. Использовали среду Раймонда с добавкой 1 или 3 % нефти, культивирование проводили при температуре 25 °С на качалке (240 об/мин), продолжительность эксперимента до 20 сут. Контролем служила стерильная среда с добавлением нефти. Нефтеокисляющую способность культуры оценивали по изменению нефтяной пленки, которая исчезала через 17 сут эксперимента. Отсюда следует, что отобранная культура микроорганизмов способна полностью утилизировать нефть, добавка которой составила 3 %, в течение 17 сут. В контрольных образцах за этот же период состояние нефти почти не изменилось.

Исследовано влияние стимулирующих добавок на динамику изменения численности УОМ в процессе культивирования почвенной суспензии. Спланировано четыре варианта сочетаний добавок в жидкой среде, включающей в себя образцы нефтезагрязненной почвы (табл. 1).

Таблица 1

Варианты сочетаний стимулирующих добавок в среде при подготовке жидкой обогащенной культуры

*Минеральные компоненты (г/л): нитроаммофоска – 2,0, NaH2PO4 – 5,0

иK2HPO4 – 3,0.

37

Влияние добавок на динамику изменения численности УОМ (NУОМ) показано на рис. 1.

Рис. 1. Динамика изменения численности УОМ в присутствии стимулирующих добавок

Во всех вариантах экспериментов стимулирующие добавки способствовали увеличению численности УОМ от 2,8·104 кл./мл (исходное содержание микроорганизмов в почвенной суспензии) до 3,5·106– 3,2·108 кл./мл (содержание после культивирования в присутствии добавок). Наибольшее стимулирующее влияние добавок проявилось в варианте 4 (минеральные компоненты – 10 г/л, нефть – 5 г/л, синтанол – 0,02 г/л ). Численность УОМ возросла в 1145 раз по сравнению с исходным уровнем и составила 3,2·108 кл./мл. Роль стимулирующих добавок сводится к следующему: минеральные компоненты – элементы питания, нефть – источник углерода, синтанол, согласно [4], – «посредник», улучшающий поступление гидрофобных органических загрязнителей из почвы внутрь микробных клеток, что создает условия для их биодеградации.

На рис. 2 приведена зависимость, характеризующая динамику накопления биомассы (оценка по количеству колоний) при культивировании в течение 20 сут.

38