книги / 387
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OECD/OCDE |
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No |
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1 |
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3 |
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du témoin |
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en % du témoin |
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exprimée en % |
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du témoin |
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trois réplicats de |
avec le |
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deux réplicats de |
doit pas |
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tissus ne doit pas |
dépasser 20 % |
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négatif, doit |
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négatif, doit |
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du témoin |
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négatif, doit |
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tissus ne doit pas |
témoin positif |
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dépasser 20 % |
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être < 50 % |
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être < 50 % |
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négatif, doit |
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être ≤ 20 % |
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dépasser 18 % |
doit être ≤ |
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3. La différence de |
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3. La différence de |
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être ≤ 30 % |
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3. La différence de |
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40 % |
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viabilité entre les |
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viabilité entre les |
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viabilité entre les |
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3. La différence de |
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3. L’écart-type |
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deux réplicats de |
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deux réplicats de |
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deux réplicats de |
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viabilité entre les |
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tissus ne doit pas |
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tissus ne doit pas |
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tissus ne doit pas |
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entre trois |
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deux réplicats de |
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dépasser 20 %. |
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dépasser 20 %. |
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dépasser 20 %. |
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tissus ne doit pas |
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réplicats de |
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dépasser 20 %. |
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tissus ne doit |
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pas |
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dépasser 18% |
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© OCDE 2019
OECD/OCDE |
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ANNEXE III - LOGIGRAMME ILLUSTRATIF PRÉSENTANT UNE SUGGESTION DE PROCÉDURE POUR L’IDENTIFICATION ET LA PRISE EN COMPTE DES PRODUITS CHIMIQUES TESTÉS RÉDUCTEURS DIRECTS DU MTT ET/OU CAUSANT UNE INTERFÉRENCE DE COULEURS, SUR LA BASE DU MODE OPÉRATOIRE NORMALISÉ DE LA MRV1
VÉRIFICATION PRÉLIMINAIRE
POUR LA RÉDUCTION
DIRECTE DU MTT
Incuber 50 μL ou 50 mg de produit chimique testé dans 1 mL de solution MTT à 1 mg/mL pendant 3 heures dans les conditions de culture normalisées
Le mélange devient-il bleu/violet ?
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Non |
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Oui |
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VÉRIFICATION PRÉLIMINAIRE POUR
L’INTERFÉRENCE DE COULEUR
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Incuber 50 μL ou 50 mg de |
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Incuber 50 μL ou 50 mg de |
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produit chimique testé dans 1 mL |
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produit chimique testé dans 2 mL |
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d’eau pendant 1 heure dans les |
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d’isopropanol pendant 2-3 heures |
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conditions de culture normalisées |
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à température ambiante |
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La DO à 570±20 nm est- |
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elle supérieure à 0.08 ? |
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Non |
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Oui |
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La couleur du produit chimique est-elle |
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trop forte pour que la vérification |
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préliminaire de réduction directe du MTT |
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soit concluante ? |
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Non |
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VÉRIFICATION |
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Incuber 50 μL ou 50 mg de produit |
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chimique testé dans 1 mL de |
PRÉLIMINAIRE |
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solution MTT à 1 mg/mL pendant |
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POUR LA |
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3 heures dans les conditions de |
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RÉDUCTION |
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culture normalisées |
DIRECTE DU MTT |
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Le mélange devient-il bleu/violet ? |
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Oui |
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Envisager l’une des deux |
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|
options suivantes |
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Non |
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Mesure DO ou |
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Mesure DO ou |
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Procédure |
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procédure |
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procédure |
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CLHP/CLUP- |
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Mesure DO |
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CLHP/CLUP- |
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CLHP/CLUP- |
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spectrophotométrie |
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spectrophotométrie |
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spectrophotométrie |
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Témoin sur tissus vivants parallèle à |
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chaque essai, selon la procédure |
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complète mais avec incubation dans |
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le milieu plutôt que dans le MTT |
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(= %CNSvivants) |
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ET |
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Témoin sur tissus tués selon la |
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Témoin sur tissus tués selon la |
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procédure complète (= %NSMTT)(un |
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|
procédure complète |
|||||||||
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seul suffit pour corriger plusieurs |
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(= %NSMTT)(un seul suffit pour |
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essais) |
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corriger plusieurs essais) |
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|
ET |
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Témoin sur tissus tués selon la |
||||
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procédure complète mais avec |
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incubation dans le milieu plutôt que |
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dans le MTT (= %CNStués)(un seul |
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suffit pour corriger plusieurs essais) |
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% viabilité finale = |
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Aucun témoin requis |
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% viabilité finale = |
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% viabilité test non corrigée |
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% viabilité test non corrigée - %NSMTT |
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- %CNSvivants - %NSMTT |
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+ %CNStués |
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Mesure DO
Témoin sur tissus vivants parallèle à chaque essai, selon la procédure complète mais avec incubation dans le milieu plutôt que dans le MTT (= %CNSvivants)
Procédure
CLHP/CLUPspectrophotométrie
% viabilité finale =
% viabilité test non corrigée Aucun témoin requis - %CNSvivants
© OCDE 2019
42 │ 492 |
OECD/OCDE |
ANNEXE IV - LOGIGRAMME ILLUSTRATIF PRÉSENTANT UNE SUGGESTION DE
PROCÉDURE POUR L’IDENTIFICATION ET LA PRISE EN COMPTE DES PRODUITS CHIMIQUES
TESTÉS RÉDUCTEURS DIRECTS DU MTT ET/OU CAUSANT UNE INTERFÉRENCE DE COULEURS, SUR LA BASE DU MODE OPÉRATOIRE NORMALISÉ DE LA MRV2
VÉRIFICATION PRÉLIMINAIRE POUR
L’INTERFÉRENCE DE COULEUR
Incuber 10 μL ou 10 mg de produit chimique testé dans 90 μL d’eau pendant
30 minutes à température ambiante
VÉRIFICATION PRÉLIMINAIRE
POUR LA RÉDUCTION
DIRECTE DU MTT
Incuber 30 μL ou 30 mg de produit chimique testé dans 300 μL de solution MTT à 1 mg/mL pendant 3 heures dans les conditions de culture normalisées
Le mélange devient-il bleu/violet ?
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Non |
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Oui |
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Le mélange se colore-t-il ? |
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Non |
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Oui |
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La couleur du produit chimique est-elle |
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trop forte pour que la vérification |
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préliminaire de réduction directe du |
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MTT soit concluante ? |
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Non |
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|
|
Incuber 30 μL ou 30 mg de |
VÉRIFICATION |
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
produit chimique testé dans |
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
PRÉLIMINAIRE |
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
300 μL de solution MTT à |
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
POUR LA |
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
1 mg/mL pendant 3 heures dans |
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
RÉDUCTION |
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
les conditions de culture |
|
|
||||||
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|
DIRECTE DU MTT |
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normalisées |
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|||||||
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Le mélange devient-il |
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|
bleu/violet ? |
|
|
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|
|
|||
|
|
Oui |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
Envisager l’une des deux |
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
options suivantes |
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
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|
|
|
|
|
|
|
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Non |
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Mesure DO ou |
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Mesure DO ou |
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Procédure |
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Procédure |
||||||||
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procédure |
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|
procédure |
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||||||||||
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CLHP/CLUP- |
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Mesure DO |
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|
Mesure DO |
|
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CLHP/CLUP- |
||||||||||||
|
CLHP/CLUP- |
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CLHP/CLUP- |
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||||||||||||||
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spectrophotométrie |
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spectrophotométrie |
||||||||||
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spectrophotométrie |
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spectrophotométrie |
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ET |
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|
Témoin sur tissus vivants parallèle à |
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|
Témoin sur tissus vivants parallèle à |
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|
chaque essai, selon la procédure |
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|
chaque essai, selon la procédure |
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complète mais avec incubation dans le |
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complète mais avec incubation dans le |
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milieu plutôt que dans le MTT |
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milieu plutôt que dans le MTT |
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(= %CNSvivants) |
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(= %CNSvivants) |
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ET |
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Témoin sur tissus tués selon la procédure |
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Témoin sur tissus tués selon la |
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|||||||||
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|
complète (= %NSMTT)(un seul suffit |
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procédure complète (= %NSMTT)(un |
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pour corriger plusieurs essais) |
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seul suffit pour corriger plusieurs essais) |
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|
Témoin sur tissus tués selon la |
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|
||||
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procédure complète mais avec |
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incubation dans le milieu plutôt que dans |
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le MTT (= %CNStués)(un seul suffit |
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||||
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|
|
|
pour corriger plusieurs essais) |
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||||
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% viabilité finale = |
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% viabilité finale = |
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|
% viabilité finale = |
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|||||||
|
Aucun témoin requis |
|
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|
|
% viabilité test non corrigée |
|
|
|
% viabilité test non corrigée |
|
|
|
Aucun témoin requis |
|
||||||||||||
|
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|
|
% viabilité test non corrigée - %NSMTT |
|
|
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|
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|
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|
||||||||||||||||
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|
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- |
%CNSvivants - %NSMTT + %CNStués |
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|
- %CNSvivants |
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|
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|
||||||||
© OCDE 2019
OECD/OCDE |
492 │ 43 |
ANNEXE V - LOGIGRAMME ILLUSTRATIF PRÉSENTANT UNE SUGGESTION DE PROCÉDURE
POUR L’IDENTIFICATION ET LA PRISE EN COMPTE DES PRODUITS CHIMIQUES TESTÉS
RÉDUCTEURS DIRECTS DU WST ET/OU CAUSANT UNE INTERFÉRENCE DE COULEURS, SUR LA BASE DU MODE OPÉRATOIRE NORMALISÉ DU TIO LABCYTE CORNEA-MODEL24
VÉRIFICATION PRÉLIMINAIRE POUR
L’INTERFÉRENCE DE COULEUR
|
|
|
|
|
|
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|
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|
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|
|
Incuber 50 μL ou 10 mg de |
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produit chimique testé dans |
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|
300 μL d’eau pendant |
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|
15 minutes à température |
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|
ambiante |
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VÉRIFICATION PRÉLIMINAIRE |
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|
POUR LA RÉDUCTION |
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Le mélange se colore-t-il ? |
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DIRECTE DU WST |
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Incuber 50 μL ou 10 mg de produit |
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|
|
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|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
chimique testé dans 300 μL de solution |
|
|
|
|
Non |
|
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|
Oui |
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|
|
|
|
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|
|
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|
|
|
||||||||||||||||||||||
|
|
WST-8 pendant 4 heures dans les |
|
|
|
|
|
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|
|
conditions de culture normalisées |
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La couleur du produit chimique est-elle |
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||||||
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|
|
trop forte pour que la vérification |
|
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||||||
|
|
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|
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|
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|
préliminaire de réduction directe du |
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||||||
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|
WST soit concluante ? |
|
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||||||
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|
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|
Non |
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|
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VÉRIFICATION |
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|
Le mélange devient-il jaune ? |
|
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|
|
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|
|
|
|
|
Incuber 50 μL ou 10 mg de |
|
|||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
produit chimique testé dans |
|
PRÉLIMINAIRE |
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|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
300 μL de solution WST-8 |
|
|
POUR LA |
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
pendant 4 heures dans les |
|
|
RÉDUCTION |
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
conditions de culture normalisées |
|
DIRECTE DU WST |
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|
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|
|
|
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|
|
|
|
|
|
|
|
Le mélange devient-il jaune ? |
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
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|
|
|
|
|
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||||
|
Non |
|
|
|
Oui |
|
|
|
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|
|
Oui |
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|||||
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|
Envisager l’une des deux |
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|
||||||
|
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|
|
|
options suivantes |
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|
Non |
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||||
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Mesure DO ou |
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Mesure DO ou |
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Procédure |
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|
Procédure |
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procédure |
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|
procédure |
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CLHP/CLUP- |
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Mesure DO |
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|
Mesure DO |
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CLHP/CLUP- |
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CLHP/CLUP- |
|
CLHP/CLUP- |
|
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|
spectrophotométrie |
|
|
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|
|
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|
|
|
|
|
|
|
|
|
spectrophotométrie |
||||||||||||
spectrophotométrie |
|
spectrophotométrie |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||
|
|
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||||||||
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|
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Témoin sur tissus vivants parallèle à |
|
|
Témoin sur tissus vivants parallèle à |
|
|
||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
chaque essai, selon la procédure |
|
|
chaque essai, selon la procédure complète |
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
complète mais avec incubation dans le |
|
|
mais avec incubation dans le milieu |
|
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||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
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|
|
|
|
|
|
|
|
milieu plutôt que dans le WST-8 |
|
|
plutôt que dans le WST-8 |
|
|
|
|
|
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
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|
(= %CNSvivants) |
|
|
|
(= %CNSvivants) |
|
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|
||||||
|
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|
|
|
|
|
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|
|
|
|
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|
|
|
|
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|
|
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|
|
Témoin sur tissus tués selon la procédure complète (= %NSWST)(un seul suffit pour corriger plusieurs essais)
Témoin sur tissus tués selon la procédure complète (= %NSWST)(un seul suffit pour corriger plusieurs essais)
Témoin sur tissus tués selon la procédure complète mais avec incubation dans le milieu plutôt que dans le WST-8 (= %CNStués)(un seul suffit pour corriger plusieurs essais)
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
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|
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|
|
|
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|
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|
% viabilité finale = |
|
|
|
% viabilité finale = |
|
|
|
% viabilité finale = |
|
|
|
|
|
|
|
Aucun témoin requis |
|
|
|
|
|
% viabilité non corrigée - %CNSvivants |
|
|
|
|
|
|
Aucun témoin requis |
|
||||
|
|
|
|
% viabilité test non corrigée - %NSWST |
|
|
|
|
|
% viabilité non corrigée - %CNSvivants |
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
- %NSWST + %CNStués |
|
|
|
|
|
|
|
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|
|
|
|
|
|
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© OCDE 2019
44 │ 492 |
OECD/OCDE |
ANNEXE VI - PRINCIPAUX PARAMÈTRES ET CRITÈRES D’ACCEPTATION DE LA PREUVE D’EFFICACITÉ D’UN SYSTÈME CLHP/CLUP-SPECTROPHOTOMÉTRIE POUR LA MESURE DU
FORMAZAN MTT EXTRAIT D’UN MODÈLE TISSULAIRE D’EChR
|
Paramètre |
Protocole dérivé des recommandations de la FDA |
|
Critères d’acceptation |
|
|
|
|
(43)(45) |
|
|
|
Sélectivité |
Analyse de l’isopropanol, du blanc vivant (extrait de |
|
Surfaceinterférence ≤ 20 % |
|
|
|
modèle tissulaire d’EChR vivant sans traitement dans |
|
SurfaceVLIQ1 |
|
|
|
l’isopropanol), du blanc tué (extrait de modèle tissulaire |
|
|
|
|
|
d’EChR tué sans traitement dans l’isopropanol) et d’un |
|
|
|
|
|
|
colorant (bleu de méthylène, par exemple) |
|
|
|
Fidélité |
Contrôles de qualité (c’est-à-dire, bleu de formazan |
|
CV ≤ 15 % ou ≤ 20 % |
|
|
|
à 1.6 µg/mL, 16 µg/mL et 160 µg/mL) dans l’isopropanol |
|
pour la VLIQ |
|
|
|
|
(n=5) |
|
|
|
Précision |
|
Contrôles de qualité dans l’isopropanol (n=5) |
|
% Écart ≤ 15 % ou |
|
|
|
|
|
≤ 20 % pour la VLIQ |
|
Effet de matrice |
Contrôles de qualité dans le blanc vivant (n=5) |
|
% Effet de matrice |
|
|
|
|
|
|
≥ 85 % et ≤ 115 % |
|
Effet résiduel |
Analyse de l’isopropanol après une VLSQ2 normale |
|
Surfaceinterférence ≤ 20 % |
|
|
|
|
|
|
SurfaceVLIQ |
|
Reproductibilité |
3 courbes d’étalonnage indépendantes (établies sur la base |
|
Courbes d’étalonnage : |
|
|
(même jour) |
de 6 dilutions de formazan au 1/3 consécutives dans |
|
% Écart ≤ 15 % ou |
|
|
|
l’isopropanol, avec point de départ VLSQ, soit |
|
≤ 20 % pour la VLIQ |
|
|
|
|
200 µg/mL) ; |
|
Contrôles de qualité : |
|
|
|
Contrôles de qualité dans l’isopropanol (n=5) |
|
% Écart |
|
Reproductibilité |
Jour 1 : 1 courbe d’étalonnage et Contrôles de qualité |
|
≤ 15 % et CV ≤ 15 % |
|
|
(d’un jour à l’autre) |
|
dans l’isopropanol (n=3) |
|
|
|
|
Jour |
2 : 1 courbe d’étalonnage et Contrôles de qualité |
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dans l’isopropanol (n=3) |
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Jour |
3 : 1 courbe d’étalonnage et Contrôles de qualité |
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dans l’isopropanol (n=3) |
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Stabilité à court terme |
Contrôles de qualité dans le blanc vivant (n=3) analysé le |
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% Écart ≤ 15 % |
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du formazan dans un |
jour de la préparation et après une conservation |
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extrait tissulaire |
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de 24 heures à température ambiante |
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d’EChR |
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Stabilité à long terme |
Contrôles de qualité dans le blanc vivant (n=3) analysé le |
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% Écart ≤ 15 % |
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du formazan dans un |
jour de la préparation et après une conservation |
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extrait tissulaire |
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de plusieurs jours à -20ºC |
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d’EChR, si nécessaire
1VLIQ : valeur limite inférieure de quantification, définie comme correspondant à une viabilité tissulaire de 1-2 %, soit 0.8 µg/mL.
2VLSQ : valeur limite supérieure de quantification, définie comme au moins deux fois la concentration maximale attendue de formazan MTT dans les extraits d’isopropanol issus des témoins négatifs
(~70 µg/mL selon la MRV), soit 200 µg/mL.
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