диссертации / 133

21

показания и алгоритмы применения методов нейровизуализации с различной разрешающей способностью для диагностики перинатальных поражений головного мозга у новорожденных и детей раннего возраста [13, 14, 18, 36].

Однако известно, что степень тяжести последующих неврологических отклонений не всегда коррелирует с глубиной структурного дефекта,

выявленного инструментальными методами исследования, что не позволяет надежно прогнозировать исход поражения ЦНС [5, 12,13, 25, 36, 50, 53, 65]. В

частности, в ряде исследований показано, что среди детей, у которых с помощью нейровизуализирующих методов обследования в течение 1-го месяца постнатальной жизни были выявлены серьезные изменения в паренхиме головного мозга, возможен исход с умеренным, преимущественно двигательным неврологическим дефицитом. Тогда как у детей, перенесших перинатальную гипоксию-ишемию и не имевших грубых структурных изменений ЦНС, могут формироваться выраженные неврологические и нейропсихические отклонения, ограничивающие социальную адаптацию

процесс на этапе обратимых нарушений. Наряду с инструментальными методами оценки, в последние годы значительное развитие получили лабораторные и нейроиммунохимические методы, позволяющие выявлять тяжесть и характер повреждения клеток нервной ткани. В настоящее время,

очевидно, что патогенетические механизмы гипоксически-ишемического поражения головного мозга необходимо рассматривать не только вследствие некроза/апоптоза, но и с позиций включения вторичного аутоиммунного механизма нейродегенерации, определяющего объем конечного дефекта и отдаленный исход церебральных повреждений [9, 24, 36]. Очевидно, что изучение прогностического значения иммунохимических нарушений, выявленных

22

в неонатальном периоде, и оценка их потенциальной роли в объективном контроле гипоксически-ишемических нарушений и эффективности нейропротекторной терапии являются перспективными направлениями клинических исследований.

В этом направлении представляет интерес исследование дипептидилпептидазы-4 (ДПП-4) и изучение её роли в патофизиологических и иммунохимических механизмах гипоксически-ишемического поражения ЦНС у новорожденных детей с различным сроком гестации.

1.2. Клиническое значение дипептидилпептидазы-4 в норме и при патологии

В научном, медицинском и фармацевтическом сообществах интерес,

вызванный исследованиями ДПП-4, нельзя недооценить. Каждый год увеличивается количество публикаций, описывающих разнообразные свойства и многочисленные функции ДПП-4 в различных областях медицины, таких как иммунология, онкология, ревматология, нейроэндокринологии и др. [112]. Так,

обсуждается роль ДПП-4 в иммунологических процессах воспаления и гипоксического повреждения тканей, участие ДПП-4 в поддержании гомеостаза глюкозы и др.

ДПП-4 (DPIV, CD26, E.C. 3.4.14.5) относится к ферментам, участвующим во множестве биологических процессов и связанных, в том числе, с

регуляцией иммунного ответа, а также с механизмами воспаления [68, 79, 84, 150].

1.2.1.Биохимическая характеристика

Известно, что пептидазы, к которым относится ДПП-4, – это ферменты

класса гидролаз, они расщепляют пептидную связь между аминокислотами в белках. Пептидазы плазматической мембраны – это ферменты, участвующие во взаимодействии клетки с факторами внешней среды, а также в межклеточных взаимодействиях, что определяет физиологический ответ клетки на меняющиеся условия окружающей среды [31]. Дипептидилпептидаза-4 (ДПП- 4) относится к сериновым протеазам и является интегральным белком

23

плазматической мембраны II типа, основная часть молекулы которой (С-

концевая область) расположена экстрацеллюлярно, вне клетки, т.е. ДПП-4

является экзопептидазой. В экстрацеллюлярной области молекулы наряду с каталитическим С-концевым доменом находятся цистеинбогатый и гликозилированные домены, а также небольшой «стебелёк», содержащий α-

спираль из 13 аминокислотных остатков. В «стебельке» находится доступная действию протеаз связь, чей гидролиз может привести к «слущиванию» основной части молекулы и образованию растворимой формы фермента.

Трансмембранный гидрофобный сегмент состоит из 22, а цитоплазматический

группе пост-пролин дипептидил-аминопептидаз, состоящей из 5 протеаз: ДПП-

4, белок активации фибробластов-α, ДПП-8, ДПП-9 и ДПП-2 [47, 84, 122, 150].

Физиологическая роль дипептидилпептидаз состоит в регуляции передачи сигналов, выполняемых пептидными гормонами. Наиболее изученной является ДПП-4. Диаминопептидазы – это ферменты, катализирующие отщепление от пептидов N-концевых α-аминокислотных остатков, а также осуществляющие гидролиз амидов α-аминокислот. ДПП-4 является узкоспециализированной аминопептидазой, присутствующей во многих клетках различных видов млекопитающих [101]. ДПП-4 составляет 95% всей диаминопептидазной активности сыворотки крови человека [74].

Впервые ДПП-4 была описана Hopsu-Havu и Glenne в 1966 году [97].

По структуре активного центра ДПП-4 – это мембраносвязанная

сериновая протеаза, каталитический центр которой включает остатки Ser624, Asp702, His734 [31]. ДПП-4 катализирует гидролиз N-концевых дипептидных фрагментов из молекул олиго- и полипептидов, содержащих преимущественно пролин или аланин в предпоследней позиции в цепочке [68, 79, 84, 120, 150, 166, 179].

Помимо своей каталитической активности, ДПП-4 выполняет фунцкию

адгезивного рецептора. Фермент способен связывать белки

24

экстрацеллюлярного матрикса гепатоцитов и фибробластов [31, 74, 166],

взаимодействовать с такими белками, как аденозиндезаминаза, белок gp120

ВИЧ, фибронектин, коллаген, рецептор хемокинов CXCR4 и тирозин фосфатазы CD45 [112]. Пептидаза задействована в процессах апоптоза [74, 166].

1.2.2.Локализация

ДПП-4 широко распространена в различных органах и тканях организма.

ДПП-4 экспрессируется на определенном типе иммунокомпетентных клеток - Т-хелперах. Установлено, что экспрессия фермента значительно увеличивается после активации данных клеток. Поэтому ДПП-4 называют кластером дифференцировки CD26 Т-хелперов [74, 112, 170]. Известно, что через молекулу CD26 происходит передача на Т-лимфоцит активационного сигнала извне, что приводит к его пролиферации и запуску синтеза провоспалительных цитокинов. В данном случае молекула фермента выполняет функции рецептора, а ее энзиматическая активность не используется [31].

Интересно отметить, что в последних публикациях ДПП-4/СД-26 -молекула Т-

клеточной дифференцировки, рассматривается шире, как общий маркер клеточной активации в иммунной системе [55, 56, 74, 112,158, 170].

Помимо иммунокомпетентных клеток, ДПП-4 экспрессируется на мембранах эпителиальных и эндотелиальных клеток различных органов [112].

ДПП-4 обнаружена в эпителии и эндотелии практически всех тканей: в печени

[85, 111, 129, 140, 149, 166, 170]; в энтероцитах кишечника [67, 166, 170]; в

почках, где она составляет до 14% от общего количества мембранных белков

[92, 129, 149, 166]; а также в щитовидной железе, лёгких, сердце, селезёнке,

костном мозге, поджелудочной железе, яичниках [92, 117, 125, 129, 148, 149, 157,170]. Кроме того, существуют данные об обнаружении ДПП-4 в меконии новорожденных [166]. В кровеносных сосудах ДПП-4 располагается в венозной части капилляра и эндотелии венул [117]. По данным исследований в легочной ткани, миокарде и поперечно-полосатой мускулатуре ДПП-4 эндотелиальных клеток капилляров этих органов определяет практически полную тканевую

25

диаминопептидазную активность [92, 117, 125]. В легких ДПП-4 также располагается в подслизистой оболочке серозных желез и альвеолярных клетках [125, 129, 157]. В селезенке и поджелудочной железе капиллярная ДПП-4 составляет около половины от её общей активности [117]. Остальную часть активности ДПП-4 в селезенке составляют Т-лимфоциты [85, 129]. По данным Poulsen MD et al. и Grondin G et al. [89, 141] в поджелудочной железе ДПП-4 присутствует в мембраносвязанном виде на эпителиальных клетках протоков и, как растворимый белок, в секреторных гранулах α-клеток поджелудочной железы. В печени ДПП-4 вырабатывается в изобилии на эпителиальных клетках желчных протоков и на гепатоцитах [85, 129]. В

корковом слое почки, ДПП-4 экспрессируется на базальной мембране клубочков, на подоцитах и на щеточной каемке проксимальных канальцев [92, 129]. Также ДПП-4 вырабатывается в тонком кишечнике [67], однако, в

эпителии толстой кишки человека ДПП-4 не обнаружена. Также мемраносвязанная форма ДПП-4 вырабатывается в фибробластах [129].

С использованием иммуногистохимических методов Bernstein HG et al., [52], обнаружили присутствие ДПП-4-иммунореактивного материала в головном мозге плодов человека, новорожденных и пожилых лиц. Было показано, что белок фермента ДПП-4 в изобилии присутствует в незрелой ЦНС человека. В противоположность этому, головной мозг взрослого человека содержит гораздо меньшую иммунореактивность дипептидилпептидазы. В

зрелом мозге ДПП-4 находится на эндотелии гематоэнцефалического барьера и на эпендимных клетках барьера мозг-ликвор. ДПП-4-позитивные нейроны встречаются только в мозге плода и их количество в дальнейшем уменьшается.

Обсуждается, что этот фермент может играть важную роль в пролиферации и/или дифференцировке нейронов, регулируя концентрации нейротрофических пептидов (IGF II, гормон роста). По данным Hartel S et al., Mentzel S et al., Gossrau R et al. [85, 92, 129] ДПП-4 экспрессируется на шванновских клетках периферических нейронов.

26

Кроме того эпителиальные клетки слюнных желез, надпочечников,

потовых желез, простаты, слезных желез, эндометрия матки и плаценты являются ДПП-4-позитивными [81, 92, 142, 129].

Известно, что в плаценте человека активность ДПП-4 высока, фермент находится в мембраносвязанной форме и локализуется на мезодермальных клетках хориона, в плацентарных ворсинках на миофибробластах, в эндотелии капилляров, особенно много его в артериолах. Растворимая форма ДПП-4

составляет только 4 % от общего количества фермента в плаценте [142].

В организме человека наряду с мембраносвязанной формой ДПП-4,

находящейся на поверхности клеточной мембраны, имеется свободная

(растворимая) форма фермента, которая образуется путём протеолитического слущивания мембраносвязанной формы ДПП-4 [31, 74, 134]. Растворимая форма определяется в сыворотке и плазме крови, моче, амниотической жидкости [101, 166], семенной жидкости [85], цереброспинальной жидкости

[106], слюне [134].

В человеческой слюне обнаружены маленькие пузырьки от 3 до 130 нм в диаметре, похожие на экзосомы, которые получены из пограничной мембраны эндосом, выделяемых разнообразными типами клеток слизистой полости рта.

Было установлено, что в пузырьках содержится метаболически активная ДПП-

4, расщепляющая субстанцию Р и глюкозо-зависимый инсулинотропный полипептид [134]. Помимо ДПП-4 экзосомы содержали галектин-3 и

иммуноглобулин А, которые играют важную роль в местной иммунной защите полости рта.

По данным исследования Durinx C et al. [73] активность ДПП-4 в плазме крови у женщин ниже, чем у мужчин и имеет тенденцию к снижению с возрастом.

1.2.3 Биологические функции

Функционирование ДПП-4 в клетке не всегда обусловлено энзиматической активностью, а часто связано со способностью образовывать комплексы с другими белковыми компонентами. ДПП-4 является

27

полифункциональным белком и, помимо ферментативной, может выполнять

рецепторную функцию [31].

Учитывая мультифункциональный характер и широкую экспрессию ДПП-4, точные функции этого пептида в естественных условиях ещё

полностью не выяснены.

ДПП-4 расщепляет множество биологически активных пептидов,

имеющих медицинское значение. ДПП-4 играет ключевую роль в модификации, обработке и/или инактивации нейропептидов, иммунопептидов,

пептидных гормонов, различных цитокинов, хемокинов и факторов роста и ряда биологически активных пептидов полученных из пищи, таких как β-

казоморфины [45, 101, 104, 112, 128,166]. Множество цитокинов, гемокинов и

факторов роста имеют N-концевые последовательности, содержащие пролин или аланин в предпоследней позиции и чувствительные к ДПП-4. Распад

пептидов с помощью ДПП-4 может привести к повышению, понижению или другим изменениям в их биологической активности [76, 112, 119, 158, 170].

Субстратами ДПП-4, среди прочих, являются субстанция Р, релизинг

фактор гормона роста (соматолиберин), нейропептид Y и пептид YY,

энтеростатин, глюкозо-зависимый инсулинотропный полипептид (GIP) и

глюкагоноподобный пептид-1(GLP-1) [45, 104, 112, 128, 158].

Физиологическими субстратами для ДПП-4 на лимфоидных клетках могут быть некоторые цитокины: интерлейкин-2, интерлейкин-1β, α и γ-

интерферон, лимфотоксин-β и другие [31].

У ДПП-4 много функций, некоторые из них опосредованы экзопептидазной активностью, такие как процессинг биоактивных пептидов и участие в резорбции пролинсодержащих пептидов. Роль ДПП-4 в иммунной системе взрослого человека при опухолевых заболеваниях, по-видимому,

связана как с ферментативным, так и с неферментативным действием.

ДПП-4 является широкораспространенным, многофункциональным,

гомодимерным гликопротеином, играющим важную роль в процессах пищеварения, механизмах обмена глюкозы, функционировании иммунной и

28

эндокринной систем, она участвует в активации костного мозга, процессах роста опухолей и клеточной адгезии.

У иммуно-супрессивных и онкологических больных, при таких заболеваниях как общая вариабельная гипогаммаглобулинемия, Т-клеточный хронический и острый лимфобластный лейкоз, Т-клеточная лимфома, рак желудка обнаружено значительное снижение активности ДПП-4 [91,96, 108].

Кроме того, ДПП-4/CD 26 считают значимым маркером для некоторых форм агрессивных Т-клеточных лимфом [160].

Также уровень активности ДПП-4 снижен у пациентов с аутоиммунными заболеваниями, такими как ревматоидный артрит, аутоиммунный хронический гепатит и системная красная волчанка [75, 118, 158, 170]. ДПП-4/CD26

сверхэкспрессируется в периферической крови на Т-лимфоцитах при ревматоидном артрите, в то время как уровень растворимой формы ДПП-4

значительно снижается, и это снижение связано со степенью активности заболевания [64].

Снижение активности ДПП-4 в сыворотке крови также наблюдается у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника, такими как болезнь Крона и неспецифический язвенный колит [93, 145].

Значительное снижение активности ДПП-4 наблюдается у пациентов с тяжелым сепсисом параллельно с увеличением уровня прокальцитонина.

Исследования Wrenger et al. показали, что прокальцитонин является субстратом для ДПП-4 [52, 169].

Активность ДПП-4 неизменно увеличивается у пациентов с циррозом печени и при тяжелых заболеваниях гепатобилиарной системы [78, 111]. У

пациентов с хроническим гепатитом С активность ДПП-4 повышается, однако значительно снижается после терапии интерфероном [121]. Активность ДПП-4

повышается в моче и сыворотке крови у пациентов с билиарной атрезией, в том числе атрезией желчных протоков. По данным проведенного исследования

Perner F et al. [140] активность ДПП-4 в сыворотке, ассоциированная с CD-26,

является новым, клинически значимым маркёром холестаза, так как в отличие

29

от уровня щелочной фосфатазы, активность ДПП-4 не изменяется при метастатических заболеваниях костей. Кроме того, повышение активности ДПП-4 в моче может использоваться, как неинвазивный метод выявления холестаза у детей, не получающих нефротоксичных препаратов. Кроме того показано повышение активности ДПП-4 при остеопорозе [86].

По данным исследований общее количество CD26 + Т-клеток памяти было снижено у ВИЧ-инфицированных больных. При этом, уровни активности ДПП-4 в сыворотке крови оставались нормальными или сниженными [54, 98].

В работе V. Stalin Raj et al [152] показано, что ДПП-4 является функциональным рецептором для коронавирусов, которые являются частыми возбудителями инфекций верхних дыхательных путей, а также могут вызывать тяжелые заболевания легких у иммуносупрессивных людей.

Изменения активности фермента отмечены при ряде психических расстройств различного генеза. В экспериментах на грызунах с недостаточностью ДПП-4, вызванной мутацией гена фермента, выявлено снижение стресс-реактивности и уменьшение депрессивно-подобного поведения в стрессовых ситуациях. Предполагается, что дизрегуляция в системе пролинспецифических пептидаз является одним из механизмов развития тревожно-депрессивных расстройств [30]. Было показано снижение активности ДПП-4 в сыворотке крови у пациентов с нервной анорексией и булемией [158]. Однако, по данным другой работы [94] обнаружено повышение активности фермента ДПП-4 у пациентов с данной патологией. Эти разнонаправленные изменения, видимо, не случайны и связаны с комбинированной дисрегуляцией ДПП-4 и нейроактивных пептидов, которые являются субстратами для ДПП-4, например нейропептид Y и пептид YY, и

могут быть неотъемлемой составляющей расстройств пищевого поведения.

В научной литературе описано изменение активности ДПП-4 при психических расстройствах. Так большая депрессия (по МКБ-10 – «тяжелый депрессивный эпизод») сопровождается низкой активностью ДПП-4 в

сыворотке крови [75, 119, 170]. Также существует ряд доказательств, что

30

лечение интерлейкином-2 (ИЛ-2) и интерфероном-α (ИФН-α) часто вызывает симптомы депрессии и активацию системного воспалительного ответа [120,

121]. Это связано с тем, что цитокины, такие как α-фактор некроза опухолей, β-

фактор преобразования роста могут ингибировать экспрессию м-РНК ДПП-4

или ферментативную активность ДПП-4 в эпителии почечных канальцев и в раковых клетках. Поэтому, можно предположить, что индукция сети цитокинов путём введения ИЛ-2 и интерферона-α может сопровождаться подавлением активности ДПП-4, что возможно связано с индукцией симптомов депрессии

[120].

Наоборот, при панических расстройствах активность фермента в крови повышена [170]. Установлено, что при синдроме хронической усталости количество лимфоцитов, экспрессирующих ДПП-4 (CD26), также повышается

[80]. Обсуждается возможное участие ДПП-4 в патогенезе аутистических расстройств у детей [101, 166, 161]. Показано, что концентрация анти-ДПП-4 IgM в сыворотке крови при аутизме вдвое больше, чем у здоровых детей [161].

Таким образом, изменение активности ДПП-4 связано с состоянием депрессии и тревоги, однако данные о направленности изменения активности фермента противоречивы и требуют уточнения и дальнейших исследований в этом направлении [30, 170].

ДПП-4 также играет ключевую роль в модификации, обработке и/или инактивации ряда веществ пищевого происхождения, таких как β-казоморфины или глиадин [101, 166]. В работе [101] обнаружена корреляция между содержанием бета-казоморфинов в молоке матери и активностью ДПП-4 в

сыворотке крови детей первого года жизни. Показано, что содержание ДПП-4 в

энтероцитах значительно снижено у детей, страдающих целиакией [72].

У новорожденных детей с синдромом ALTE (apparent life threatening events - внезапное жизнеугрожающее состояние) обнаружена низкая активность ДПП-4 в сыворотке крови. Предполагается существование взаимосвязи между наличием казоморфинов в питании детей, активностью ДПП-4 и

предрасположенностью детей первого года жизни к апноэ [166]. Активность