диссертации / 97

может быть связан с мембранными везикулами, содержащими Hsp70. Эти везикулы могут высвобождаться из клеток и затем поглощаться другими клетками за счет слияния мембран или посредством рецепторного взаимодействия [De Maio, 2011].

В одной из первых публикаций на эту тему описано, что после высвобождения Hsp70 из глии во внеклеточное пространство этот белок затем может интернализовываться в окружающие нейроны в аксональной области синапсов, где концентрация внутриклеточного белка меньше, чем в теле нейрона [Tytell et al., 1986].

Разнообразие рецепторов, взаимодействующих с Hsp70 или опосредованно активированных с участием Hsp70, указывает на то, что эти белки взаимодействуют со множеством типов клеток и выполняют целый комплекс функций вне клетки.

Внескольких исследованиях продемонстрировано, что HSP70

оказывают различные эффекты на клетки иммунной системы [Srivastava, 2002; Calderwood et al., 2005]. HSP70 обладают иммунорегуляторными свойствами, воздействуя на клетки врожденной иммунной системы через рецепторы клеточной мембраны, такие как CD91 [Basu et al., 2001], TLR2 и TLR4 [Asea et al., 2002], СD40 [Becker et al., 2002]. Как известно, активация

CD40 на АПК имеет важную костимулирующую роль для развития Т-

клеточного ответа и взаимодействия компонентов врожденного и приобретенного иммунитета. Следует учесть, что данные о способности

Hsp70 связываться с CD40 противоречивы [Becker et al., 2002; Binde, 2009].

Ряд рецепторов к модифицированным липопротеинам из семейства скавенджер-рецепторов, LOX-1 и SREC-1, FEEL-1/CLEVER-1 могут не только связываться с HSP70, но и способствовать интернализации HSP70 [Thériault et al., 2006].

41

Показано, что Hsp70 может активировать фрагмент С1q системы комплемента и запускать каскад системы комплемента по классическому пути [Prohaszka et al., 2002].

Hsp70 обладает способностью к индукции продукции и высвобождения провоспалительных маркеров. Через связывание с рецепторами TLR2 и TLR4

запускаются воспалительные сигналы в макрофагах, дендритных клетках

(ДК), нейтрофилах. Показано, что связывание внеклеточного Hsp70 с TLR2

или TLR4 на плазматической мембране моноцитов и макрофагов вызывает активацию потока ионов Ca2+, чего не происходит при активации этих рецепторов с помошью LPS. В дальнейшем в этих клетках происходит активация транскрипционного фактора NF-kappaβ и усиление экспрессии провоспалительных цитокинов TNFα, IL-1β, IL-6 и IL-12 совместно с активацией CD14 в качестве корецептора [Asea et al., 2000]. При совместной инкубации АПК с внеклеточным Hsp70 возрастает продукция NO,

потенциально апоптогенного медиатора [Panjwani et al., 2002].

Таким образом, экзогенный Hsp70 может выступать в качестве сигнала опасности для системы врожденного иммунитета и стимулировать иммунный ответ.

Было показано, что за иммунологические эффекты отвечают специфические фрагменты молекулы Hsp70. Пептид, локализованный в С-

терминальном домене (359-610 а.о.) индуцирует продукцию хемокинов,

созревание ДК, продукцию цитокинов, таких как IL-12, стимулирующих иммунный ответ по типу Th1, тогда как N-терминальный домен такими свойствами не обладает [Wang et al., 2002].

Многие исследователи акцентируют внимание на том, что используемый в экспериментах in vitro рекомбинатный Hsp70 может давать стимулирующий иммунный ответ за счет контаминации LPS. В моделях in vitro на мышиных и крысиных макрофагах было показано, что очищенный от

LPS Hsp70 не стимулировал высвобождение воспалительных цитокинов [Gao

42

and Tsan, 2003; Johnson and Fleshner, 2006]. Однако последующие эксперименты с использованием рекомбинантного Hsp70 небактериального происхождения подтвердили способность этого белка проявлять иммунорегуляторные свойства [Zheng et al., 2010]. Было доказано in vivo, что стресс-индуцируемый внеклеточный Hsp70 эндогенного происхождения обладает активирующим действием на клетки иммунной системы [Vega et al., 2008; Kovalchin et al., 2006; Gastpar et al., 2004].

Показано, что Hsp70 может проникать через сосудистую стенку локально в очаг воспаления, обусловленного бактериальным заражением.

Локальное увеличение концентрации внеклеточного Hsp70 после стресса коррелировало с усилением иммунного ответа в месте введения патогена,

ограничиением распространения очага заражения и более быстрым течением восстановления после заражения. Введение ингибитора проницаемости сосудов (антагониста гистаминовых рецепторов H1 кетотифена) не увеличивало локальную концентрацию внеклеточного Hsp70. Описанные эффекты отменялись при нейтрализации антителами против Hsp70 в очаге воспаления [Johnson and Fleshner, 2006].

Аутоиммунные заболевания, такие как артриты, рассеянный склероз,

инсулинзависимый диабет, сопровождаются хроническим воспалением и деструкцией тканей. В крови больных этими заболеваниями повышен уровень циркулирующих HSP в виде потенциальных аутоантигенов, и

антител к ним. Описан эффект ингибирования развития процесса хронического воспаления в моделях некоторых аутоиммунных заболеваний при иммунизации экзогенными HSP, в частности, Hsp70 бактериального происхождения. Считают, что этот эффект опосредован активацией популяции низкоаффинных аутореактивных CD4+ регуляторных T-клеток,

синтезирующих противовоспалительный цитокин IL-10. Такая иммуносупрессивная Т-клеточная активация возможна в результате узнавания на поверхности АПК эпитопов собственных Hsp70 в комплексе с

43

МНС класса II, высокогомологичных бактериальным эпитопам [Hauet-Broere et al., 2006].

В то же время, известно, что при аутоиммунных заболеваниях стресс-

индуцируемая экспрессия Hsp70 на клеточной поверхности усугубляет развитие хронического воспаления. Считается, что происходит активация АПК и Тh1-клеточного ответа при возрастании концентрации аутоантигена

Hsp70 за счет высвобождения из поврежденных тканей, а также в результате кросс-реактивности T-клеток на эпитопы собственных Hsp70, гомологичных чужеродным эпитопам Hsp70 патогена. Активации АПК со стороны Hsp70

сопровождается усиленной продукцией иммуностимуллирующего цитокина

IFNγ, что обуславливает усиление воспалительного иммунного ответа

[Pockley et al., 2008].

Как было доказано в моделях на крысах, HSP70 может оказывать антисептическое действие и эффективно защищать от эндотоксинового шока,

а также модулировать ответ миелоидных клеток при стимуляции LPS,

увеличивая выживаемость и стабилизируя гемостаз и ряд других гемодинамических характеристик [Rozhkova et al., 2010].

Hsp70 был обнаружен на поверхности многих опухолевых клеток, в том числе в комплексе с опухолевыми антигенами [Multhoff et al., 1997; Sapozhnikov et al., 2002]. Поверхностная экспрессия Hsp70 на опухолевых клетках играет важную роль в клеточных взаимодействиях, усиливая распознавание опухоли клетками иммунной системы [Bausero et al., 2005].

Все эти особенности HSP легли в основу изучения противоопухолевой активности HSP70 в составе вакцин. Иммунизация комплексом HSP70-

опухолевый пептид усиливает синтез антител к пептидам, снижает уровень метастазирования опухолевых клеток в мышиных моделях, благодаря активации специфического СD8+ T-клеточного ответа, тогда как введение чистого HSP70 такого эффекта не вызывает [Udono and Srivastava, 1993].

Противоопухолевые вакцины на основе HSP70 потенциально стимулируют

44

не только адаптивный, но и врожденный противоопухолевый иммунитет. Это возможно благодаря взаимодействию молекул NKG2A на поверхности NK-

клеток с молекулой Hsp70, экспрессируемой опухолевым клетками

[Srivastava, 2002].

В то же время, описаны механизмы с участием Hsp70, которые обеспечивают активацию роста опухоли. В основном это связано с уже описанным ранее противоапоптозным действием HSP70, а также за счет взаимодействия Hsp70 с незрелыми формами клеток миелоидного происхождения MDCS с фенотипом CD11b+CD33+HLA-DR– (у человека) или

Ly-6C/G CD11b (у мышей), количество которых в организме, где развивается опухоль, возрастает. При воздействии на MDCS опухолевыми экзосомами,

содержащими Hsp70, индуцируется антиген-специфическая толерантность

CD8+ T-клеток. Молекула Hsp70 может запускать активацию в MDCS

транскрипционного фактора Stat3 через TLR2 и аутокринную продукцию IL- 6 [Chalmin et al., 2010].

Внеклеточные HSP70 рассматриваются как шаперокины, то есть проявляют свою активность не только в качестве шаперонов, но и цитокинов

[Asea et al., 2000].

Преобладающее большинство литературных данных, освещающих внеклеточные функции HSP70, относятся к индуцируемой форме этого белка

Hsp70, но среди них встречаются публикации, в которых описывается роль конститутивной формы Hsc70 вне клетки. Так, на тепловой ответ в нервных клетках активируется синтез не только Hsp70, но также процесс транслокации эксперссируемого Hsc70 в области синапсов, где эта молекула осуществляет нейропротективные функции во время стресса [Chen and Brown, 2007].

Таким образом, можно сделать вывод, что влияние, оказываемое in vitro

и in vivo внеклеточным Hsp70, может быть активирующим или ингибирующим. Эти эффекты зависят от множества факторов. К таким

45

факторам относятся происхождение Hsp70 (из нормальной клетки, из клетки,

инфицированной вирусом, из опухолевой клетки, из бактерии); локализация белка (циркуляция или транслокация на внешней клеточной поверхности);

вид стресса (окислительный стресс, бактериальная или вирусная инфекция,

физическая нагрузка).

1.4.4. HSP70 в нейтрофилах

На основании морфологических данных об особенностях хроматиновой структуры ядра и незначительном количестве эндоплазматического ретикулума и рибосом некоторое время считали, что нейтрофилы препрограммированы на функционирование без значительной биосинтетической активности [Сline, 1966; Murphy, 1976]. Позднее было обнаружено, что в этих клетках происходит активация генов и синтез белков,

в частности ряда хемокинов, и что это играет значительную роль в клеточных взаимодействиях при воспалении [Jack and Fearon, 1988; Shaun et al., 1992; Beaulieu et al., 1992].

С помощью метода включения меченого метионина [35S] и разделения клеточного лизата в градиентном геле была продемонстрирована способность нейтрофилов синтезировать Hsp70 [Eid et al., 1987].

Несмотря на то, что ранее считалось, что Hsp70 экспрессируется на поверхности лишь опухолевых клеток [Multhoff et al., 1995], была определена локализация Hsp70 на поверхности нейтрофилов [Giraldo et al., 2010].

Внеклеточные Hsp70 стимулируют хемотаксис нейтрофилов, и этот эффект является дозозависимым [Ortega et al., 2009]. Индукция HSP70 в апоптозных нейтрофилах способствует усилению продукции TNFα макрофагами [Zheng et al., 2004].

46

1.5.HSP70 и окислительный стресс

Вмодели эндотелиальных клеток была исследована возможность окислительного стресса индуцировать экспрессию HSP. Нагревание,

добавление H2O2 и последующий анализ с помощью Вестерн-блоттинга показал, что ТШ индуцирует быстрое и значительное увеличение уровня мРНК Hsp70. Добавление H2O2 тоже приводит к такому эффекту, но количество накопленных мРНК на порядок меньше. Кинетика синтеза Hsp70

коррелирует с накоплением мРНК [Jornot et al., 1991].

Продемонстрировано, что шаперонная активность очищенных Hsp70 и Hsc70 возрастает в условиях окислительного стресса [Callahan et al., 2002].

У трансгенных по Hsp70 дрозофил экспрессия Hsp70 увеличивается при усилении продукции АФК, что дает авторам основание предположить наличие совместной работы HSP и антиоксидантных компонентов [Gupta et al., 2007].

Экзогенный HSP70 значительно ингибирует LPS-индуцированную продукцию АФК в различных миелоидных клетках [Rozhkova et al., 2010].

Показано, что ТШ или обработка клеток ионами металла кадмия,

которые индуцируют синтез HSP, в том числе Hsp70, в нейтрофилах вызывают временное ингибирование NADPH-оксидазы, без изменения их фагоцитозной активности [Maridonneau-Parini et al., 1988]. Однако в безъядерных цитопластах после воздействия ТШ продукция O2* также временно ингибируется, вероятно, потому, что ТШ изменяет механизм транслокации и сборки компонентов NADPH-оксидазы. С другой стороны,

первичное нагревание нейтрофилов предотвращало ингибирование продукции O2* при вторичном нагревании, что, могло быть связано с термотолерантностью. При блокировании синтеза HSP во время первичного нагревания, эффект ингибирования NADPH-оксидазы выявлялся вновь во время повторного ТШ. Таким образом, была продемонстрирована взаимосвязь между защитным механизмом от продукции O2* и синтезом HSP,

47

однако не исключено, что активность NADPH-оксидазы и синтез HSP

являются хотя и сопутствующими, но не прямо связанными явлениями

[Maridonneau-Parini et al., 1993].

В то же время продемонстрировано взаимодействие HSP70 и NOX4 (конститутивно активный фермент NADPH-оксидазы, преимущественно экспрессируемый в гладкомышечных клетках) в клетках проксимальных почечных канальцев. После транслокации HSP70 на мембрану активность

NADPH-оксидазы уменьшается, чего не наблюдается при инкубации с антителами против HSP70. Таким образом, транслокация HSP70, снижая активность NOX4, оказывает цитопротективный эффект [Bocanegra et al., 2010].

1.6.Механизмы секреции HSP70

Внастоящее время известно, что высвобождение HSP70 во внеклеточное пространство может происходить как пассивным путем при клеточной гибели путем некроза, так и посредством активной секреции [De Maio, 2011].

Продемонстрировано, что апоптоз, индуцированный облучением, не приводит к высвобождению HSP70, тогда как некроз, вызванный многократным замораживанием и оттаиванием, приводит к выбросу клеточного содержимого, в том числе и HSP70 [Basu et al., 2000].

Механизмы активного высвобождения HSP70 во внеклеточное пространство до сих пор обсуждаются. Считается, что HSP70 не секретируются по механизму классического экзоцитоза, так как аминокислотная последовательность молекул внутриклеточных HSP70 не содержит лидирующего пептида, который необходим для экзоцитоза по классическому механизму через систему транспорта ЭПР-Гольджи [Mambula et al., 2007]. Однако полученные иммуногистохимическими методами данные указывают на то, что в клетках HeLa новосинтезированная молекула Hsp70

48

локализуется в комплексе Гольджи [Schneider et al., 2002]. Несмотря на то,

что в большинстве исследований ингибитор классического экзоцитоза брефелдин А не оказывал влияния на уровень секреции белка, есть данные,

что в клетках карциномы А431 брефелдин А все же ингибировал процесс высвобождения HSP70 во внеклеточное пространство [Evdonin et al., 2006].

Подобно молекулам без лидирующей последовательности IL-1α и -1β,

для которых известны несколько механизмов высвобождения из клеток, в

литературе также описаны разнообразные альтернативные пути высвобождения Hsp70 в отсутствие некроза, реализованные по неклассическому механизму секреции или нетрадиционными путями.

Для IL-1β описан путь секреции в составе секреторных лизосомных эндосом, или эндолизосом, которые сливаются с плазматической мембраной и высвобождают свое содержимое во внеклеточное пространство [Andrei et al., 1999]. Hsp70 был обнаружен внутри лизосом [Nylandsted et al., 2004].

Впоследствии возможность высвобождения HSP70 в составе секреторных эндосомальных лизосом была показана для некоторых опухолевых клеток и макрофагов. Предполагается, что в процессе транслокации Hsp70 в лизосому может участвовать транспортная система ABC-транспортеров (АTP-binding cassette) [Mambula and Calderwood, 2006]. В то же время представлены данные, что в клетках производных кератиноцитов в высвобождение Hsp70

вовлечен везикулярный транспорт, при котором секреторные гранулы,

содержащие Hsp70, не несут специфических маркеров эндосом, лизосом и липидов, но несут маркер секреторных гранул – хромогранин А [Evdonin et al., 2006].

Одним из альтернативных механизмов рассматривается выход во внеклеточное пространство в составе секреторных внеклеточных везикул, к

которым относят экзосомы, микрочастицы и эктосомы. Экзосомы представляют собой везикулы, образованные из плазматической мембраны в результате эндоцитоза и упакованные в мультивезикулярные тельца в

49

результате инвагинации эндосомной мембраны. Эти тельца могут сливаться с клеточной поверхностью и экзосомы высвобождаются наружу. Этот механизм отличается от механизма образования микрочастиц и эктосом непосредственно из плазматической мембраны в результате ее выпячивания.

Высвобождение Hsp70 в составе экзосом наблюдали в макрофагах

[Bhatnagar et al., 2007], в В-клетках, подвергнутых ТШ, и в мононуклеарных клетках, нативных и стрессированных нагреванием [Clayton et al., 2005; Hunter-Lavin et al., 2004; Lancaster and Febbraio, 2005]. Экзосомный механизм высвобождения Hsp70 описан при стимуляции опухолевых клеток провоспалительными цитокинами IFNγ и IL-10 [Bausero et al., 2005]. Следует уточнить, что при такой стимуляции высвобождение в экзосомах было частичным, так как Hsp70 высвобождался во внеклеточное пространство и в свободной форме. Одним из факторов, способствующих высвобождению

Hsp70 в составе экзосом, может являться активация симпатической нервной системы. Высвобождение норадреналина и последующая активация α1-

адренорецепторов увеличивает запас внутриклеточного Ca++, что, как считают авторы, может стимулировать секрецию экзосом с содержащимся в них Hsp70 [Johnson and Fleshner, 2006]. Более того, по всей видимости,

существует два пути высвобождения Hsp70 в составе экзосом. В ответ на ТШ на В-лимфоцитах увеличивается количество высвобождаемых экзосом,

содержащих внутри Hsp70 [Clayton et al., 2005], в то время как в моноцитах человека в ответ на стресс увеличивается концентрация Hsp70 внутри и на поверхности экзосом без увеличения их количества [Lancaster and Febbraio, 2005].

Также было показано, что после стресса Hsp70 интегрируется в липидный бислой мембраны и высвобождается во внеклеточное пространство в мембрано-ассоциированном состоянии в виде везикул.

Внеклеточные мембраны, заключающие в себе Hsp70, многократно эффективнее, чем очищенный рекомбинантный белок, индуцировали

50