диссертации / 97

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и

Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

(ИБХ РАН)

________________________________________________________________

На правах рукописи

Бойко Анна Александровна

ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА

70 КДА И ЕГО ВЗАИМОСВЯЗЬ С ПРОДУКЦИЕЙ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В НЕЙТРОФИЛАХ ЧЕЛОВЕКА ПРИ СТАРЕНИИ

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Коваленко Елена Ивановна

Москва, 2015 г.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений……………………………………………………………..5

Введение…………………………………………………………………………..8

I. Обзор литературы……………………………………………………………10

1.1.Нейтрофилы, их характеристика…………………………………………...10

1.1.1.Нейтрофильные гранулы……………………………………………11

1.1.2.Поверхностные маркеры нейтрофилов…………………………….14

1.2.Функции нейтрофилов и их роль в системе иммунитета………………...17

1.2.1.Фагоцитоз…………………………………………………………….17

1.2.2.Дегрануляция………………………………………………………...20

1.2.3.Нейтрофильные внеклеточные ловушки…………………………..22

1.2.4.Активные формы кислорода в нейтрофилах………………............22

1.2.4.1.Пути образования и метаболиты АФК в нейтрофилах.............23

1.2.5.Роль нейтрофилов в патологических процессах…………………..26

1.3.Регуляция активности нейтрофилов……………………………………….28

1.4.Белки теплового шока………………………………………………………30

1.4.1.Семейство белков теплового шока 70 кДа. ……………………......32

1.4.2.Внутриклеточные функции HSP70…………………………………35

1.4.3.Внеклеточные функции HSP70…………………………………......40

1.4.4.HSP70 в нейтрофилах………………………………………………..46

1.5.HSP70 и окислительный стресс…………………………………………….47

1.6.Механизмы секреции HSP70…………………………………………….....48

1.7.Причины и иммунологические аспекты процесса старения …………….52

1.7.1.Основные теории развития старения……………………………….52

1.7.2.Ассоциированные с возрастом изменения в нейтрофилах…….....53

1.7.3. HSP70 при старении…………………………………………………54

II. Материалы и методы……………………………………………………….56

2.1. Реагенты……………………………………………………………………..56

2

2.2.Выделение нейтрофилов из периферической крови и подготовка образцов…………………………………………………………………………..57

2.3.Проточная цитофлуориметрия……………………………………………..59

2.3.1.Оценка жизнеспособности нейтрофилов…………………………..59

2.3.2.Цитометрический анализ внутриклеточного уровня HSP70……...60

2.3.3.Цитометрический анализ поверхностной экспрессии HSP70 и

маркеров дегрануляции………………………………………………………….60

2.3.4.Цитометрическое измерение внутриклеточной

продукции АФК………………………………………………………….....61

2.4. Анализ внутриклеточного содержания HSP70 методом Вестерн-

блоттинга…………………………………………………………………………61

2.5.Измерение продукции АФК с помощью люминол-зависимой хемилюминесценции…………………………………………………………….62

2.6.Статистический анализ данных……………………………………………63

2.7.Измерение транскрипционной активности генов HSP70 с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (qRT-PCR)…...63

2.7.1.Проведение qRT-PCR………………………………………………..64

2.7.2.Статистическая обработка данных qRT-PCR……………………...65

2.8.Оценка внеклеточного уровня HSP70 с помощью ИФА…………………65

III. Результаты……………………………………………………………….....67

3.1.Внутриклеточное содержание HSP70 в интактных нейтрофилах в разных возрастных группах……………………………………………………………...67

3.2.Динамика изменения уровня HSP70 в нейтрофилах под действием теплового шока…………………………………………………………………..68

3.2.1.Транскрипционная активность генов белков HSP70 в нейтрофилах под действием теплового шока…………………………………………………68

3.2.2.Анализ динамики внутриклеточного уровня HSP70 в нейтрофилах под действием теплового шока…………………………………………………71

3.3.Анализ экспрессии HSP70 в мононуклеарных клетках человека………..73

3

3.4.Анализ двухфазной динамики внутриклеточного уровня HSP70 в

нейтрофилах под действием теплового шока………………………………….75

3.5.Воздействие гипертермии на уровень HSP70 в нейтрофилах в разных

3.6.Высвобождение HSP70 из нейтрофилов во внеклеточное пространство……………………………………………………………………..82

3.7.Анализ механизмов, регулирующих высвобождение HSP70 во внеклеточное пространство из нейтрофилов…………………………………..84

3.8.Спонтанная и индуцированная продукция АФК в разных возрастных группах…………………………………………………………………………...89

3.9.Анализ взаимосвязи между продукцией АФК и содержанием HSP70 в

нейтрофилах в разных возрастных группах…………………………………...92

IV. Обсуждение……………………………………………………………….....95

Выводы…………………………………………………………………………105

Список литературы…………………………………………………………...106

4

Список сокращений

АДФ – нуклеотид аденозиндифосфат

АПК – антиген-презентирующие клетки

АТФ – нуклеотид аденозинтрифосфат

АФК – активные формы кислорода

АФКDCF спонт – спонтанный внутриклеточный уровень АФК в неактивированных нейтрофилах, измеренный с помощью флуоресцентного зонда DCFH-DA

АФКЛЗХ спонт – спонтанный уровень АФК в неактивированных нейтрофилах,

измеренный с помощью метода люминол-зависимой хемилюминесценции

АФКЛЗХ инд – индуцированная опсонизированным зимозаном продукция АФК в нейтрофилах, измеренная с помощью метода люминол-зависимой

хемилюминесценции

ЛЗХ – люминол-зависимая хемилюминесценция

СОД – фермент супероксид дисмутаза

ТШ – тепловой шок

ЭПР – эндоплазматический ретикулум

BiP (binding immunoglobulin protein) – белок, связывающий

иммуноглобулины

BPI (bactericidal/permeability-increasing protein) – катионный белок,

обладающий бактерицидной и LPS-связывающей активностью

CR1 (CD35) – рецептор к фрагменту системы комплемента 1

CXCL8 (IL-8) – интерлейкин 8

DCFH-DA (2'-7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate) – проницаемый флуоресцентный зонд, уровень флуоресценции которого пропорционально зависит от концентрации H2O2

FcγRIIA (CD32) – Fc-рецептор для иммуноглобулинов

fMLP (formyl-1-methionyl-1-leucyl-1-phenylalanine) – хемоаттрактант

G-CSF – гранулоцитарный колонестимулирующий фактор

5

GM-CSF – гранулоцитарно-макрофагальный колонестимулирующий фактор

GPCR – суперсемейство трансмембранных гликопротеиновых

«серпентиновых» рецепторов, связанных с внутриклеточными GTP-

связанными белками

Hsc70 – конститутивный белок HSP70

HSF (heat shock factor) – транскрипционный фактор, инцициирующий транскрипцию генов HSP

HSP – белки теплового шока

Hsp70 – индуцируемый белок HSP70

HSP70 – семейство белков теплового шока 70 кДа HSP70базальный – содержание HSP70 в интактных нейтрофилах

HSP70ТШ – уровень HSP70, зарегистрированный сразу после окончания ТШ

ΔHSP70ТШ – параметр, который рассчитывается в виде разницы между

HSP70ТШ и HSP70базальный

IFNγ – гамма-интерферон

ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) – цитоплазматическая сигнальная последовательность

ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) – последовательность,

деактивирующая тирозиновые рецепторы

LFA-1 (CD11a/CD18) – высокоафинный рецептор адгезии

LPS – липополисахарид

LTВ4 – лейкотриен B4

Mac-1/ СR3 (CD11b/CD18) – рецептор адгезии

MAP – митоген-активированная протеинкиназа

mTOR (mammalian target of rapamycin) – сигнальный путь, ингибируемый

рапамицином

NET – нейтрофильные внеклеточные ловушки

O2* – супероксид анион-радикал

OH* – гидроксил радикал

6

PAF (platelet activating factor) - хемоаттрактант

PI3К – фосфатидилинозитол-3-киназа

PMA (phorbol meristat acetate) – активатор протинкиназы С

SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive-fusion-protein attachment protein receptor) – семейство белков, обеспечивающих в слиянии мембран гранул и везикул с плазматической мембраной во время фагоцитоза и экзоцитоза

TLR (Toll-like receptors) – рецепторы врожденного иммунитета

TNFα/βR – рецептор фактора некроза опухоли

7

Введение

В настоящее время старение рассматривается как сложный биологический процесс, который протекает на фоне разнообразных молекулярных и функциональных изменений в организме. Самая известная из теорий, объясняющих причины старения, утверждает, что чрезмерное образование свободных радикалов, особенно активных форм кислорода

(АФК), совместно с нарушением защитной системы клеток от клеточного стресса, способствует старению организма [Harman, 1956]. С одной стороны АФК осуществляют элиминацию патогена и клиренс поврежденных тканей, а

с другой стороны, интенсивная продукция АФК усугубляет воспалительные реакции, оказывая повреждающее влияние не только на мишени, но и на собственные ткани организма.

Один из механизмов, обеспечивающих защиту клеток от неблагоприятных последствий действия АФК, связан с участием высоко консервативных белков теплового шока семейства 70 кДа (HSP70). Белки

HSP70 обладают широким спектром шаперонных функций и способствуют нормальному протеканию многих внутриклеточных процессов. Они обеспечивают устойчивость клеток к стрессу, участвуя в процессах дезагрегации, репарации и элиминации поврежденных в условиях стресса белков. Нарушение HSP70-опосредованных механизмов, связанных с поддержанием белкового гомеостаза, может быть одним из факторов,

ускоряющих старение.

Нейтрофилы, клетки врожденной иммунной системы, представляют важный источник АФК в организме и могут играть значительную роль в процессе старения. Известно, что нейтрофилы прямо или косвенно участвуют в патогенезе многих заболеваний, связанных с возрастом. В

нейтрофилах, несмотря на их низкую биосинтетическую активность, как и во всех эукариотических клетках, экспрессируются белки HSP70. В то же время,

работ, в которых бы изучались особенности экспрессии и роль HSP70 в

функционировании нейтрофилов, мало. Нет информации о возрастных

8

изменениях, связанных с уровнем внутриклеточных HSP70 в нейтрофилах.

До сих пор не ясно, участвуют ли HSP70 в регуляции процессов продукции АФК нейтрофилами.

Таким образом, актуальным является изучение в рамках одной работы вопросов, связанных с возрастными изменениями экспрессии HSP70 и

генерации АФК в популяции нейтрофилов, а также анализ взаимосвязи внутриклеточного уровня HSP70 с продукцией АФК. Немаловажным также представляется оценка способности нейтрофилов продуцировать внеклеточные формы HSP70, играющие иммунорегуляторную роль [De Maio, 2011]. Изучение этих вопросов может способствовать более глубокому пониманию процесса старения, а также позволить сформулировать стратегию коррекции патологических состояний, ассоциированных с возрастом, в

которых нейтрофилы играют существенную роль.

Цель исследования – изучение возрастных особенностей внутриклеточного содержания HSP70 и динамики стресс-индуцированных изменений уровня HSP70, а также анализ взаимосвязи этих изменений с продукцией АФК в нейтрофилах человека.

Задачи исследования:

1.Проанализировать содержание HSP70 в нейтрофилах человека в трех возрастных группах: молодые, пожилые и долгожители.

2.Исследовать динамику изменения внутриклеточного уровня HSP70 в

нейтрофилах в ответ на тепловой шок и выявить факторы, влияющие на эту динамику.

3.Сравнить динамику изменения внутриклеточного содержания HSP70

внейтрофилах в ответ на тепловой шок в разных возрастных группах.

4.Оценить спонтанную и индуцированную продукцию АФК в нейтрофилах в разных возрастных группах.

5.Изучить взаимосвязь содержания HSP70 и продукции АФК, а также ее возрастные особенности.

9

I. Обзор литературы

1.1. Нейтрофилы, их характеристика

Полиморфноядерные (сегментоядерные) гранулоциты, или нейтрофилы,

составляют преобладающую популяцию лейкоцитов в крови млекопитащих и реализуют первую линию защиты в системе врожденного иммунитета,

обеспечивая ответ организма на бактериальные и грибковые инфекции.

Нейтрофилы образуются в костном мозге из стволовых мультипотентных гемопоэтических клеток в миелопоэзе. Последовательные этапы дифференцировки миелоидных предшественников нейтрофилов (миелобласт,

промиелоцит и миелоцит) завершаются фазой созревания нейтрофилов в метамиелоцит, палочкоядерную и зрелую сегментоядерную формы, которые характеризуются ультраструктурными изменениями ядра и гранул. После цикла дифференцировки, который составляет в зависимости от степени активности процесса от 7 до 10 дней, около 10% созревших нейтрофилов попадают из костного мозга в кровоток, большая часть зрелых нейтрофилов депонируется в синусах костного мозга. Пополнение зрелых клеток в кровяном русле ежедневно составляет порядка 1011 клеток, а концентрация нейтрофилов в крови варьирует в диапазоне 3-5×106/мл. Доля циркулирующих в крови зрелых сегментоядерных нейтрофилов составляет от 45% до 75% от общего количества лейкоцитов человека. Эти клетки также представлены в виде регионального пула, выстилающего внутреннюю поверхность капилляров в ткани легких, печени и селезенки [Peters, 1998].

Средняя продолжительность циркуляции нейтрофилов в кровотоке составляет 8-20 ч, после чего, если их не активируют факторы воспаления,

нейтрофилы мигрируют в ткани. После миграции в ткани продолжительность жизни нейтрофилов составляет, как правило, 1-2 дня, затем они подвергаются спонтанному апоптозу и уничтожаются макрофагами, тем самым минимизируя повреждения ткани цитотоксическим содержимым своих гранул [Fox et al., 2010]. Пролонгация времени жизни нейтрофилов

10