72
средством и используется под торговыми названиями «Ловастатин», «Ловакор», «Мевакор» и др. Церуленин, ингибитор синтазы жирных кислот, находится на этапе доклинических испытаний. Изначально планировалось использование церуленина в борьбе с ожирением [128, 129], однако последующие исследования неожиданно показали его эффективность в отношении клеток рака толстого кишечника [130], рака молочной железы [131] и рака простаты [132]. Изучение ловастатина также показало его способность подавлять канцерогенез. Ловастатин замедляет рост и вызывает апоптоз клеток рака поджелудочной железы [133], злокачественной глиомы [134], рака простаты [135], и рака молочной железы [136]. Обнаруженная in vitro эффективность обоих веществ в отношении различных форм рака указывает на то, что механизм действия данных препаратов затрагивает базовые внутриклеточные пути канцерогенеза. Можно предположить, что в опухолях, ассоциированных с НФ II, не смотря на их доброкачественную природу, задействованы те же самые процессы. Таким образом, ловастатин и церуленин, выбранные по результатам скрининга и прошедшие первичную валидацию, потенциально являются перспективными препаратами в борьбе в новообразованиями, возникающими при НФ II.
Исследование механизма действия ловастатина в отношении Nf2- отрицательных клеток
Эксперименты по подавлению действия статинов.
Ловастатин является ингибитором 3-гидрокси-3-метилглутарил-коА редуктазы, фермента, который осуществляет синтез холестерола из мевалоната. Статины блокируют первую стадию синтеза – превращение ацетил-коА в мевалонат (рис. 24).
73
Рисунок 24. «Схема синтеза холестерола»
Чтобы выяснить, какой из этапов синтеза является ключевым для жизнедеятельности Nf2-отрицательных клеток, в среду совместно с ловастатином добавили холестерол или промежуточные продукты. Холестерол и ланостерол (первый продукт, содержащий скваленовое кольцо) не влияли на токсичность статинов, однако фарнезилфосфат и геранилгераниолфосфат полностью подавляли действие статинов (рис. 25).
Рисунок 5. «Подавление действия статинов при добавлении фарнезилфосфата и геранилгераниолфосфата»
74
ФФ – фарнезилфосфат, ГГФ – геранилгераниолфосфат. Фарнезилфосфат или геранилгераниолфосфат в концентрации 5мкМ добавляли вместе с указанными концентрациями симвастатина через 4 часа после высева клеток и инкубировали 48 часов. Эксперименты повторяли в трипликатах 4 раза. На графиках отображены средние значения и доверительный интервал для вероятности 95%
Истощение внутриклеточного пула геранилгераниола – ключевого звена селективной токсичности статинов
Геранилгераниолфосфат и фарнезилфосфат необходимы для пренилирования и заякоривания на мембране некоторых белков (рис. 26).
75
Рисунок 26. «Внутриклеточные функции промежуточных продуктов синтеза холестерола»
Поскольку геранилгераниолфосфат может быть синтезирован в клетке из фарнезилфосфата, были использовали различные ингибиторы фарнезилтрансфераз и геранилтрансфераз, чтобы выяснить, какой из процессов определяет селективную токсичность статинов. Ингибиторы фарнезилтрансфераз (фарнезилтиосалициловая кислота) показали одинаково низкую токсичность в отношении обеих клеточных линий. Только ингибиторы геранилтрансферазы обладали селективной токсичностью в отношении Nf2-отрицательных клеток (рис. 27)
76
Рисунок 27. «Ингибиторы геранилтрансфераз обладают селективной токсичностью в отношении Nf2-отрицательных клеток»
Золедронат – неспецифический ингибитор геранилтрансфераз, GGTI-298 – специфический ингибитор геранилтрансферазы I. Эксперименты повторяли в трипликатах 4 раза. На графиках отображены средние значения и доверительный интервал для вероятности 95%
77
Учитывая, что специфический ингибтор геранилтрансферазы I GGTI-298 проявил выраженную селективную токсичность в отношении Nf2-отрицательных клеток, можно предположить, что именно нарушение геранилирования белков геранилтрансферазой I (GT I) определяет селективную токсичность ловастатина в отношении этих клеток.
При активации Rac1 нарушение её геранилирования приводит к клеточной гибели.
К белкам, геранилируемых GT I, относятся малые ГТФазы семейств Rho, Rac, Ral и Rap, субъединицы G-белков и др. Отличительным признаком геранилируемых белков является наличие С-концевой последовательности CAAX, где C – цистеин, А – алифатические аминоксилоты, X – L, F, I, V или M. Поскольку наиболее значимыми мишенями GT I являются ГТФазы семейств Rho и Rac, мы применили ингибиторы активности этих ферментов. Ингибирование ГТФазы RhoA привело к незначительному снижению количества жизнеспособных клеток MEF Nf2-/-, а ингибирование Rac1 – к незначительному его повышению. Поскольку RhoA ингибирует Rac1, было выдвинуто предположение, что играть роль может не ингибирование, а, наоборот, активация ГТФаз Rac. Химическое и генетическое повышение активности Rac привело к потенциированию эффекта статинов, в особенности, в Nf2-положительных клетках (рис. 28 и 29).
78
Рисунок 28. «Активатор ГТФаз семейства Rac потенциирует эффект симвастатина»
А)
Б)
А) Активатор ГТФаз семейства Rac EHT1864 добавляли в указанных концентрациях через 4 часа после высева клеток и инкубировали 48 часов.
Б) EHT1864 в концентрации 5 мкМ (~IC50 для клеток MEF NF2f/f) добавляли вместе с указанными концентрациями симвастатина через 4 часа после высева клеток и инкубировали 48 часов. Эксперименты повторяли в трипликатах 4 раза. На графиках отображены средние значения и доверительный интервал для вероятности 95%
79
Рисунок 29. «Генетическая активация ГТФаз семейства Rac потенциирует эффект симвастатина»
Клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f трансфецировали пдизмидными векторами pCDNA3-Cdc42 или pCDNA3-Rac1 (отрицательный контроль) и pCDNA3-Cdc42L61 или pCDNA3-Rac1L61, кодирующими перманентно активные формы белков Cdc42 и Rac1. Через сутки после трансфекции в культуральную среду добавили указанные концентрации симвастатина и инкубировали 48 часов. Эксперименты повторяли в трипликатах 4 раза. На графиках отображены средние значения и доверительный интервал для вероятности 95%
80
Поскольку известно, что мерлин является ингибитором Rac, и в Nf 2- отрицательных клетках наблюдается их патологическая активация, можно предположить, что нарушение геранилирования и, следовательно, заякоривания активированной Rac на мембране вызывает клеточную гибель.
Выключение гена Rac1, как и следовало ожидать, приводило к подавлению токсичности симвастатина (рис. 30). Выключение генов других ГТФаз семейства Rac и Cdc42 не давало столь выраженного эффекта антагонизма.
Рисунок 30. «Подавление эффекта симвастатина при выключении гена
Rac1»
Клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f трансфецировали некодирующей миРНК (отрицательный контроль) и миРНК против гена Rac1. Через сутки после трансфекции в культуральную среду добавили указанные концентрации симвастатина и инкубировали 48 часов. Эксперименты повторяли в трипликатах 4 раза. На графиках отображены средние значения и доверительный интервал для вероятности 95%
Транслокация Rac1 в ядро под действием статинов
С помощью флуоресцентной микроскопии было установлено, что под действием статинов происходит транслокация Rac1 в ядро. Клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f трансфецировали плазмидным вектором, кодирующим фьюжнбелок Rac1-GFP, и через 24 часа после трансфекции в среду был добавлен
81
симвастатин. Через час инкубации с симвастатином в большинстве клеток линии MEF Nf2-/- Rac1 визуализировалась преимущественно в ядре. Тем не менее, через 24 часа транслокация наблюдалась уже в обеих клеточных линиях (рис. 31)
Рисунок 31. «Транслокация Rac1 в ядро в отсутствие геранилирования»
Клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f инкубировали с 1 мкМ симвастатином в течение суток. Микроскопию осуществляли на инвертированном флуоресцентном микроскопе, увеличение 20х
Для сравнения активности ядерной фракции Rac1 в клеточных линиях был использован метод резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) (рис. 32). Для этого клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f были трансфецированы плазмидными векторами, кодирующими сенсоры активности Rac1: белок-фьюжн Rac1-CFP и белок-фьюжн Pid-YFP, являющийся субстратом Rac1. Исследование показало, что в клетках линии MEF Nf2-/- Rac1 под действием статинов активируется, а в клетках линии MEF Nf2f/f её активность не меняется (рис. 32)
82
Рисунок 32. «Измерение активности ядерной Rac1 с помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии»
А)
Б)
Клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f котрансфецировали плазмидными векторами pCyPet-Rac1 и pYPet-PID и инкубировали с 1 мкМ симвастатином в течение суток. А) 1 – клетки, инкубированные с ДМСО (отр. контроль), 2 – клетки, инкубированные с симвастатином. Микроскопию осуществляли на конфокальном флуоресцентном микроскопе Leica TCS SP8, увеличение 40х. На рисунке представлены наложение изображений с детекторов сигналов CFP и YFP и обработанные изображения, демонстрирующие отсутствие (синий цвет) или наличие (оранжевый цвет) FRET. Б) Измерения проводили с помощью встроенного программного обеспечения. В качестве контролей засветки каналов выполняли индивидуальные трансфекции векторами pCyPet-Rac1 и pYPet-PID. Представлены средние значения и доверительный интервал для вероятности 95%.
83
Таким образом, было доказано, что статины вызывают истощение внутриклеточного пула геранилгераниола, приводящее к нарушению геранилирования малых ГТФаз, в частности Rac1. Под действием статинов Rac1 разъякоривается, отсоединяется от клеточной мембраны и транслоцируется в ядро. В Nf2-отрицательных клетках разъякоренная Rac1 активируется и вызывает клеточную гибель. Ранее было показано, что статины могут вызывать активацию Rac [137]. По-видимому, именно эта дополнительная активация позволила определить разницу в уровнях активации Rac между Nf2-отрицательными и контрольными клетками.
Хорошо описана роль активации Rac в молекулярных механизмах канцерогенеза. Например, были описаны фосфорилирование киназ семейства Pak [138] и активация фактора транскрипции Stat3 [139] активной формой Rac. Однако есть лишь одна статья [8], демонстрирующая роль активированной Rac1 в цитоплазме. Ядерные цитотоксические функции Rac1 до сих пор не были описаны и подлежат дальнейшему изучению.
Ингибиторы синтазы жирных кислот (FASN) как потенциальные препараты
для фармакотерапии НФ II
Церуленин – второе по эффективности соединение, прошедшее валидацию
– является ингибитором синтазы жирных кислот. Поскольку фармакологические аналоги церуленина обладают селективной токсичностью в отношении Nf2- отрицательных клеток, можно предположить, что этот фермент имеет большое значение для клеток опухолей, развивающихся в результате утраты гена Nf2. Был проведён ряд экспериментов, чтобы установить причину, по которой нормальное функционирование Fasn особенно важно именно для Nf2-отрицательных клеток.
84
Сходство эффектов от нокдауна гена Fasn и действия церуленина на Nf2- отрицательные клетки.
Наряду с химическим ингибированием Fasn были применены малые интерферирующие РНК против гена синтазы жирных кислот Fasn. Клетки линий MEF Nf2-/- and MEF Nf2flox/flox трансфецировали шпилечной РНК против гена Fasn в плазмидном векторе pGFP-V-RS. Данный вектор содержит ген зелёного флуоресцентного белка (GFP), позволяющий идентифицировать успешно трансфецированные клетки по зелёной флуоресценции. Через 24 часа после трансфекции в чашках с клетками MEF Nf2-/-, трансфецированными РНК против гена Fasn, наблюдались округлившиеся всплывшие клетки, подвергшиеся апоптозу (рис. 33). В чашках с клетками MEF Nf2-/-, трансфецированными контрольной РНК, а также в чашках с клетками MEF Nf2f/f клеточной гибели не наблюдалось.
85
Рисунок 33 «Выключение гена Fasn в клетках линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f»
Клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f трансфецировали вектором T30013 c некодирующей шпилечной РНК (отрицательный контроль) и вектором co шпилечной РНК против гена Fasn. Микроскопию проводили через сутки на инвертированном флуоресцентном микроскопе при 20-кратном увеличении.
Для количественной оценки апоптоза, вызванного выключением гена Fasn, а также для сравнения действия церуленина с эффектом нокдауна Fasn, был выполнен иммуноблоттинг с антителами против ээфекторной каспазы 3, которая
86
является надёжным индикатором апоптоза. Для приготовления лизатов для блоттинга были использованы 6 групп образцов: клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2flox/flox , трансфецированные миРНК против гена Fasn, клетки, трансфецированные контрольной РНК, и клетки, трансфецированные контрольной РНК и инкубированные с 10µM церуленином в течение 12 часов. Значительное повышение уровня апоптоза наблюдалось только в лизатах клеток MEF Nf2-/-, трансфецированных шпилечной РНК против гена Fasn, и MEF Nf2-/-, подвергнутых действию церуленина (рис. 34). Ещё одним отличием Nf2- отрицательных клеток от контрольных оказалось снижение уровня экспрессии Fasn под действием церуленина, которое наблюдалось только в клетках линии
MEF Nf2-/-.
Рисунок 34 «Сравнение действия церуленина и выключения гена Fasn в клетках линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f»
Клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f трансфецировали некодирующей миРНК (отрицательный контроль) и миРНК против гена Fasn. Через сутки после трансфекции к части клеток, трансфецированных контрольной РНК, добавили 10мкМ церуленин и инкубировали 12 часов. Эксперименты повторяли в дубликатах 3 раза. На графиках отображены средние значения и доверительный интервал для вероятности 95%
87
Эксперименты по снижению цитотоксического действия церуленина.
Эксперименты с химическим ингибированием и генетическим выключением синтазы жирных кислот доказали, что селективность церуленина связана с его прямым механизмом действия и обусловлена зависимостью Nf2- отрицательных клеток от нормального функционирования Fasn. При выключении метаболического пути гибель клетки может наступать либо в результате дефицита конечного продукта данного пути, либо из-за накопления токсичных промежуточных метаболитов. Fasn осуществляет каскад реакций синтеза насыщенных жирных кислот, постепенно наращивая углеродную цепочку от малоната (С3) к пальмитату (С16) (рис. 35).
Рисунок 35 «Основные реакции синтеза насыщенных жирных кислот»
Поскольку для каждой из протестированных клеточных линий (MEF Nf2-/-, MEF Nf2f/f, SC4-9 и RT4) IC50 церуленина в бессывороточной и полнй среде не отличалась, а добавление 5 µM пальмитата не уменьшало токсичности церуленина, мы сделали вывод, что апоптоз, вызываемый данным соединением, не обусловлен дефицитом жирных кислот. В то же время, известно, что церуленин блокирует раннюю стадию синтеза жирных кислот – конденсацию
88
малонил-коА, – что приводит к накоплению в клетках малоната [30, 31]. Малонил-коА, утилизируемый синтазой жирных кислот, синтезируется из ацетилкоА ферментом ацетил-коА карбоксилазой (Acc).
Рисунок 36 «Химическое модулирование синтеза жирных кислот»
Чтобы убедиться, что в данном случае механизм действия церуленина не отличается от уже описанного, действие церуленина было оценено в клетках с выключенным геном ацетил-коА карбоксилазы (Acaca). Клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f трансфецировали миРНК против гена Acaca и сравнили действие церуленина на клетки с выключенным геном Acaca и клетки, трансфецированные контрольной миРНК (рис. 37).
89
Рисунок 37 «Снижение токсичности церуленина при выключении гена Асаса»
Клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f трансфецировали некодирующей миРНК (отрицательный контроль) и миРНК против гена Acaca. Через сутки после трансфекции в культуральную среду добавили указанные концентрации церуленина и инкубировали 48 часов. Эксперименты повторяли в трипликатах 4 раза. На графиках отображены средние значения и доверительный интервал для вероятности 95%
90
Снижение уровня экспрессии гена Acaca подтвердили иммуноблоттингом
(рис. 38):
Рисунок 38 «Оценка эффективности выключения гена Асаса с помощью РНК-интерференции»
Acaca – лизаты клеток, трансфецированных миРНК против гена Acaca, Конт. РНК – лизаты клеток, трансфецированных некодирующей РНК. Иммуноблоттинг выполнили с поликлональными антителами против ацетил-КоА карбоксилазы 1 и моноклональными антителами против Gapdh
Химическое ингибирование Acc 5-тетрадецилокси-2-фуроевой кислотой (ТОФК) также повышало IC50 церуленина (рис. 39).
91
Рисунок 39 «Снижение токсичности церуленина при химическом ингибировании Асс»
Ингибитор Асс тетрадецилоксифуроевую кислоту (ТОФК) в концентрации 25 мкМ (~IC50 для клеток MEF NF2-/-) добавляли вместе с указанными концентрациями церуленина через 4 часа после высева клеток и инкубировали 48 часов. Эксперименты повторяли в трипликатах 3 раза. На графиках отображены средние значения и доверительный интервал для вероятности 95%
92
Активация Acc 5-йодотуберцидином, наоборот, делала клетки более чувствительными к церуленину (рис. 40).
Рисунок 40 «Реактивация Асс с помощью 5-йодотуберцидина»
Активатор Асс йодотуберцидин в концентрации 2 мкМ (~IC50 для клеток MEF NF2f/f) добавляли вместе с указанными концентрациями церуленина через 4 часа после высева клеток и инкубировали 48 часов. Эксперименты повторяли в трипликатах 3 раза. На графиках отображены средние значения и доверительный интервал для вероятности 95%
93
Примечательно, что эффект ТОФК более заметен на клетках MEF Nf2-/-, а действие 5-йодотуберцидина, наоборот, сильнее проявляется на MEF Nf2flox/flox.
Подавление конденсации малонила, опосредованное церуленином, приводит к повышению внутриклеточного уровня малоната, токсичного для клеток. Поскольку конденсация блокируется в любых типах клеток, разница в чувствительности к церуленину может объясняться различием в уровне синтеза жирных кислот. Было показано, что у некоторых раковых клеток повышена скорость липогенеза [125]. Мы предположили, что в клетках опухолей, возникающих при НФ II, несмотря на их доброкачественную природу, может наблюдаться такой же метаболический сдвиг.
Различия внутриклеточных уровней ацетил-коА и малонил-коА в клетках
линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2flox/flox
Для подтверждения гипотезы о различных уровнях метаболизма в опухолевых и нормальных клетках, мы измерили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спетрометрией (ВЭЖХ/МС) уровни ацетилкоА и малонил-коА в клетках линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f, часть которых была обработана церуленином (рис. 41)
94
Рисунок 41 «Измерение внутриклеточных уровней ацетил-коА и малонилкоА с помощью ВЭЖХ/МС»
Клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f инкубировали с ДМСО или 5мкМ церуленином в течение 48 часов, после чего трипсинизировали и приготовляли образцы, как описано в разделе «Материалы и Методы». Определение внутриклеточных уровней ацетил-КоА и малонил-КоА проводили с помощью УВЭЖХ-МС/МС. Эксперименты повторяли 3 раза, на графиках отображены средние значения и доверительный интервал для вероятности 95%
95
Результаты эксперимента подтверждают резкое повышение уровня метаболизма в Nf2-отрицательных клетках, а также свидетельствуют о различной реакции клеток MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f на воздействие церуленина. Было обнаружено двукратное повышение базового уровня ацетил-коА в клетках MEF Nf2-/-. Базовые уровни малонил-коА в клетках MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f отличались незначительно, что, по-видимому, объясняется более высокой скоростью потребления малоната Nf2-отрицательными клетками в последующих реакциях. Под действием церуленина в клетках MEF Nf2-/- содержание ацетил-коА и, особенно, малонил-коА резко повышалось (десятикратная разница для малонилкоА). В клетках MEF Nf2f/f уровни данных соединений под действием церуленина не менялись или даже понижались (ацетил-коА), что свидетельствует о существовании отрицательной обратной связи, нарушающейся с утратой гена Nf2.
Повышенный уровень синтеза жирных кислот в Nf2-отрицательных клетках
Синтаза жирных кислот осуществляет синтез насыщенных жирных кислот de novo, используя малонил-коА в качестве исходного материала. Малонил-коА синтезируется из ацетил-коА ацетил-коА карбоксилазой. Хотя непосредственно реакции синтеза осуществляются Fasn, в процессе липогенеза участвует множество вспомогательных ферментов, необходимых для синтеза молекулпредшественников и для утилизации продуктов (рис. 42)
96
Рисунок 42 «Схема синтеза насыщенных жирных кислот»
Для оценки различий в уровне синтеза жирных кислот в клетках MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f, был выполнен иммуноблоттинг с антителами против Fasn, Acc, Acl, Acecs1, Acsl1 и фосфо-Aсс и фосфо-Acl (рис. 43 и 44). Уровень Fasn и, что ещё важнее, Асс, оказались существенно повышены в клетках MEF Nf2-/-. Иммуноблоттинг также показал, что уровень фосфорилирования Асс в этих клетках значительно ниже, чем в контрольных, что является признаком повышения активности этого фермента (рис. 43 и 44). Низкий уровень фосфорилирования Асс в клетках MEF Nf2-/- объясняет их слабую чувствительность к 5-йодотуберцидину, механизм действия которого связан с дефосфорилированием Асс. И, соответственно, отсутствие эффекта ТОФК в клетках MEF Nf2f/f объясняется низким уровнем экспрессии Асс в этих клетках. Иммуноблоттинг также выявил значительное повышение уровня экспрессии остальных белков, участвующих в липогенезе, в клетках MEF Nf2-/- (рис. 43 и 44)
97
Рисунок 43 «Продукция и фосфорилирование белков, участвующих в синтезе жирных кислот, в клетках линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f»
Клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f инкубировали с ДМСО или 10мкМ церуленином в течение 48 часов, после чего отмывали мёртвые клетки, а остальные анализировали методом иммуноблоттинга, как описано в разделе «Материалы и методы». В качестве первичных антител использовали набор Fatty Acid and Lipid Metabolism Antibody Sampler Kit (Cell Signaling Technology, США, № 8335). В качестве контроля загрузки использовали Gapdh. Эксперименты повторяли 4 раза. Лизаты каждого типа загружали в 2 лунки для контроля качества переноса. На рисунке представлены типичные результаты.
98
Рисунок 44 «Количественная оценка продукции и фосфорилирования белков, участвующих в синтезе жирных кислот, в клетках линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f»
99
– p ≤ 0,05; ** – p ≤ 0,01; *** – p ≤ 0,001; **** – p ≤ 0,0001; # – 0,1 ≤ p ≤ 0,05
Изображения, полученные при иммуноблоттинге, проанализировали с помощью программы ImageJ. Интенсивность полосок, соответствующих исследуемому белку, нормализовали к интенсивности полоски, соответствующей Gapdh. На графиках представлены средние значения и доверительный интервал для вероятности 95%
Также была выполнена количественная ПЦР (кПЦР) для оценки уровня экспрессии генов белков, участвующих в липогенезе (рис. 36). Результаты к ПЦР показали значительное повышение уровня экспрессии всех исследуемых генов в клетках линии MEF Nf2-/-, причём наиболее существенные различия наблюдались в группе генов, продукты которых связаны с реакциями бета-окисления жирных кислот (рис. 45).
100
Рисунок 45 «Экспрессия генов белков, участвующих в реакциях синтеза и β- окисления жирных кислот»
*** – p ≤ 0,001
Клетки линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f выращивали в бессывороточных условиях. Количественную ПЦР с обратной транскриптазой выполняли с использованием проб Taqman к указанным генам. Уровень экспрессии исследуемых генов нормализовали к среднему значению уровней экспрессии генов домашнего хозяйства Actinb, Tbp1 и Hrpt. Эксперименты повторяли 4 раза, на графиках представлены средние значения и доверительный интервал для вероятности
95%.
Реэкспрессия белка мерлин в клетках линии SC4-9 приводила к снижению уровня продукции белков, вовлечённых в липогенез (рис. 46 и 47), повышению уровня фосфорилирования Асс (рис. 46 и 47) и снижению экспрессии генов белков, участвующих в синтезе жирных кислот (рис. 48)
101
Рисунок 46 «Влияние белка мерлин на продукцию и фосфорилирование белков, участвующих в синтезе жирных кислот»
Клетки линии SC4-9, трансфецированные плазмидным вектором pBabe (отр. контроль) и вектором pBabe-NF2, кодинующим белок мерлин, инкубировали с ДМСО или 10мкМ церуленином в течение 48 часов, после чего отмывали мёртвые клетки, а остальные анализировали методом иммуноблоттинга, как описано в разделе «Материалы и методы». В качестве первичных антител использовали набор Fatty Acid and Lipid Metabolism Antibody Sampler Kit (Cell Signaling Technology, США, № 8335). В качестве контроля загрузки использовали Gapdh. Эксперименты повторяли 4 раза. Лизаты каждого типа загружали в 2 лунки для контроля качества переноса. На рисунке представлены типичные результаты.
102
Рисунок 47 «Влияние белка мерлин на продукцию и фосфорилирование белков, участвующих в синтезе жирных кислот»
103
– p ≤ 0,05; ** – p ≤ 0,01; *** – p ≤ 0,001; **** – p ≤ 0,0001; # – 0,1 ≤ p ≤ 0,05
Изображения, полученные при иммуноблоттинге, проанализировали с помощью программы ImageJ. Интенсивность полосок, соответствующих исследуемому белку, нормализовали к интенсивности полоски, соответствующей Gapdh. На графиках представлены средние значения и доверительный интервал для вероятности 95%
Рисунок 48 «Влияние белка мерлин на экспрессию генов белков, участвующих в реакциях синтеза и β-окисления жирных кислот»
*** – p ≤ 0,001
Клетки линииSC4-9, трансфецированные плазмидным вектором pBabe (отр. контроль) и вектором pBabe-NF2, кодинующим белок мерлин, выращивали в бессывороточных условиях. Количественную ПЦР с обратной транскриптазой выполняли с использованием проб Taqman к указанным генам. Уровень экспрессии исследуемых генов нормализовали к среднему значению уровней экспрессии генов домашнего хозяйства Actinb, Tbp1 и Hrpt. Эксперименты повторяли 4 раза, на графиках представлены средние значения и доверительный интервал для вероятности
95%.
104
Наблюдаемые отличия в уровнях экспрессии генов и продукции белков в клетках SC4-9-Babe и SC4-9-мерлин не так велики, как в клетках MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f, поскольку исследования выполнялись не на клонах с контролируемой экспрессией мерлина, а на смешанной популяции трансфецированных клеток, и эффективность трансфекции составляла ≈ 30% (см. рис. 22).
Обнаруженные различия в уровнях экспрессии генов и продукции и фосфорилирования белков, вовлечённых в синтез жирных кислот, доказывают, что липогенез значительно повышен в Nf2-отрицательных клетках. В то же время, повышение экспрессии генов и продукции белков, связанных с бета-окислением жирных кислот, а также различия в реакции клеток MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f на воздействие церуленина (например, противоположные изменения уровня Acsl1, см. рис. 43 и 44) позволяют предположить, что утрата гена Nf2 вызывает нарушения бета-окисления жирных кислот, что может служить дополнительным механизмом селективности церуленина.
Эксперименты по изучению противоопухолевой активности ловастатина, золендроновой кислоты и церуленина
вксенографтной модели НФII на мышах
Висследованиях in vitro были установлены механизмы селективной цитотоксичности ингибиторов 3-гидрокси-3-метилглутарил-коА редуктазы и синтазы жирных кислот, что позволило предположить, что данные классы соединений могут стать перспективными средствами терапии НФ II. Следующим этапом доклинических испытаний этих веществ стали исследования на животных. Был проведёг ряд ксенографтных экспериментов на бестимусных мышах (nu/nu) с использованием клеток линий RT4 и SС4-9 (рис. 49).
105
Рисунок 49 «Тестирование ловастатина, зометы и церуленина в ксенографтной модели НФ II на мышах»
А)
106
А) Ксенографты с использованием клеток крысиной шванномы. Бестимусным мышам (n = 6) вводили 1 млн клеток, ресуспендированных в физиологическом растворе. Введение масляных суспезий церуленина в дозе 2 мг/кг/день, ловастатина в дозе 1 мг/кг/день или золедроновой кислоты в дозе 0,4 мг/кг/день с помощью желудочного зонда начинали на 3-й день эксперимента. Через 3 недели лечения опухоли извлекали.
107
Б)
Б) Ксенографты с использованием клеток мышиной шванномы. Бестимусным мышам (n = 5) вводили 3 млн клеток, ресуспендированных в матригеле. Введение масляных суспезий церуленина в дозе 2 мг/кг/день, ловастатина в дозе 1 мг/кг/день или золедроновой кислоты в дозе 0,4 мг/кг/день с помощью желудочного зонда начинали на 3-й день эксперимента. Через 4 недели лечения опухоли извлекали.
108
Введение исследуемых препаратов не приводило к уменьшению объёма уже сформированных опухолей. Однако все три соединения значительно замедляли рост опухолей при использовании их в качестве профилактических средств, то есть, если лечение начинали вскоре после введения опухолевых клеток.
Вэкспериментах были использованы относительно низкие дозы препаратов
всвязи с их высокой токсичностью. Умеренность лечебного действия церуленина может быть объяснена его крайне низкой биодоступностью (около 3%) Также, известно, что церуленин и его синтетический аналог С75 вызывают серьёзные побочные эффекты, включая резкую потерю веса [129]. В данных исследованиях мыши хорошо переносили вводимый препарат, потери веса не наблюдалось, однако и лечебный эффект был умеренным. Возможно, следующие поколения аналогов церуленина с лучшей биодоступностью и меньшим числом побочных действий будут обладать большей противоопухолевой активностью.
109
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Была разработана клеточная система для исследования гена Nf2 in vitro и выполнен химический скрининг с использованием этой системы. Из девяти соединений-кандидатов, отобранных по результатам скрининга, два: ингибитор 3- гидрокси-3-метилглутарил-коА редуктазы ловастатин и ингибитор синтазы жирных кислот церуленин – успешно прошли валидацию и были отобраны для последующих испытаний.
Было доказано, что ингибирование 3-гидрокси-3-метилглутарил-коА редуктазы вызывает истощение внутриклеточного пула геранил-гераниола, что приводит к разъякориванию малой ГТФазы Rac1 и отсоединению её от клеточной мембраны. Было установлено, что Rac1 активируется под действием статинов только в Nf2-отрицательных клетках. Было также показано, что активация Rac1, не ассоциированной с клеточной мембраной, приводит к клеточной гибели. Ранее подобная роль Rac1 описана не была. В последующих исследованиях предстоит выяснить механизм Rac1-опосредованной клеточной гибели.
Также было доказано, что утрата гена Nf2 приводит к метаболическому сдвигу, заключающемуся в резком повышении скорости синтеза жирных кислот. Nf2-отрицательные клетки зависимы от нормального функционирования синтазы жирных кислот. Данные исследования позволяют предположить, что утрата гена Nf2 приводит к нарушению бета-окисления жирных кислот, что негативно отражается на энергетическом метаболизме этих клеток. Снижение продукции энергии и повышенные энергетические потребности, обусловленные высокой скоростью роста, приводят к резкому повышению синтеза жирных кислот и зависимости от нормального функционирования участвующих в синтезе ферментов.
Полученные результаты позволяют предположить обусловленные утратой гена Nf2 глубокие сдвиги во всех метаболических путях. Известно, что для раковых клеток характерна триада метаболических изменений: предпочтение гликолиза перед митохондриальным окислением (эффект Варбурга), повышение
110
уровня липогенеза и повышение уровня глютаминолиза. В данной работе было подтверждено повышение уровня липогенеза в Nf2-отрицательных клетках. Последующие исследования будут направлены на оценку остальных метаболических путей в этих клетках.
Несмотря на множество открытых вопросов, очевидно, что синтаза жирных кислот, геранилтрансфераза I и 3-гидрокси-3-метилглутарил-коА редуктаза представляют собой перспективные мишени для фармакотерапии НФ II. Гиполипидемические препараты группы статинов, воздействующие на 3- гидрокси-3-метилглутарил-коА редуктазу и препарат золедроновой кислоты Зомета, применяющийся для лечения остеопороза и являющийся ингибитором геранилтрансферазы I, являются уже одобренными к применению лекарственными средствами, и, таким образом, для этих препаратов могут быть начаты клинические испытания II и III фазы на пациентах с НФ II. И хотя церуленин и его аналоги пока находится на стадии доклинических испытаний, повышенный интерес к этой группе веществ позволяет надеяться, что вскоре появится эффективное лекарственное средство, блокирующее синтазу жирных кислот, которое можно будет применять для терапии НФ II.