2

ОГЛАВЛЕНИЕ

3

2.8 Количественная ПЦР (кПЦР) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

2.9 Измерение внутриклеточных уровней ацетил- и малонил-КоА . . . . . . . 42

2.10Измерение флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) . 43

2.11Исследования противоопухолевой активности препаратов на

5

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

НФ II – нейрофиброматоз второго типа РАК – р21-активируемые киназы

RAC – RAS-related C3 botulinum toxin substrate (родственный антигену крысиной саркомы субстрат ботулинического токсина С3)

HRS – HGF-regulated kinase substrate (субстрат киназы, регулируемой гепатоцеллюлярным фактором роста)

MTOR – mammalian target of rapamycin, белок-мишень рапамицина млекопитающих ЛВ – лекарственные вещества

ЦНС – центральная нервная система ПНС – периферическая нервная система ВШ – вестибулярная шваннома

Rb – retinoblastoma protein (ретинобластомный белок)

RAS – rat sarcoma, онкоген крысиной саркомы ERM – семейство эзрин-радиксин-моэзин

RHO – RAS homolog gene family, семейство гомологов RAS

ПКА – протеинкиназа А

PIP – фосфатидилинозитолфосфат MYPT – миозинфосфатаза

CPI 17 – малый белок-ингибитор фосфатаз, регулируемый протеинкиназой С, с молекулярной массой 17 kDa

ERK – extracellular signal-regulated kinases, киназы, регулируемые внеклеточной сигнализацией

CDK4 – cyclin-dependent kinase 4 (циклин-зависимая киназа 4) PI3K – киназа фосфатидилинозитола-3-фосфата

AKT – v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1 (гомолог онкогена вирусной мышиной тимомы v-akt), протеинкиназа В

6

ERBB – V-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog, гомолог онкогена вирусной эритробластной лейкемии птиц

RTK – рецепторные тирозин-киназы

STAT – signal transducers and activators of transcription, передатчики сигнала и активаторы транскрипции

STAM – signal transducing activator molecule, молекула-активатор передачи сигнала

CRL4 – cullin-RING ubiquitin ligase 4, убиквитинлигаза, содержащая куллин и цинковый палец, 4

PDGFR – platelet-derived growth factor receptor, рецептор тромбоцитарного фактора роста

EGFR – epithelial growth factor receptor, рецептор эпителиального фактора роста VEGFR – vascular endothelial growth factor receptor, рецептор эндотелиального фактора роста

MEK – mitogen-activated kinases, митоген-активируемые киназы

RAF – v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog, гомолог онкогена вирусной саркомы мышей

DCAF – DDB1 CUL4 associated factor, фактор, ассоциированный с CRL4-

убиквитинлигазой ЭР – рецепторы эстрогена

CD20 – В-лимфоцитарный поверхностный антиген кластера дифференцировки 20 ЛДГА – лактатдегидрогеназа ПДК – киназа пируватдегидрогиназы

FASN – fatty acid synthase, синтаза жирных кислот

DMEM – Dulbecco’s minimal essential medium, модифицированная по Дульбекко среда Игла

MEF – mouse embryo fibroblasts, мышиные эмбриональные фибробласты

GFP – green fluorescent protein, зелёный флуоресцентный белок CFP – cyan fluorescent protein, голубой флуоресцентный белок YFP – yellow fluorescent protein, жёлтый флуоресцентный белок

7

дНТФ – динуклеотидтрифосфаты ДМСО – диметилсульфоксид

FDR – false discovery rate, доля ложноположительных отклонений миРНК – малые интерферирующие РНК ПХ – пероксидаза хрена ЩФ – щелочная фосфатаза

ПЦР – полимеразная цепная реакция Fasn – ген синтазы жирных кислот Acc – ацетил-коА карбоксилаза

Acaca – ген ацетил-коА карбоксилазы 1

Асaсb – ген Acc2 Lpin1 – ген Lipin1

Acl – АТФ-цитратлиаза Acly – ген АТФ-цитратлиазы

Acecs1 – ацетил-коА синтетаза Acss2 – ген ацетил-коА синтетазы

Acsl1 – long fatty acid acyl-coA ligase, лигаза длинноцепочечных жирных ацил-коА Acsl1 – ген лигазы длинноцепочечных жирных ацил-коА

Srbp1 – ген стерольного регуляторного элемента Srebp1 Cpt1c – ген карнитилпальмитоилтрансферазы Iγ

Cpt2 – ген карнитилпальмитоилтрансферазы II ТФЭ – твердофазная экстракция

УВЭЖХ-МС – ультравысокоэффективная жидкостная хроматография с массспектрометрией

FRET – fluorescence resonance energy transfer, резонансный перенос энергии флуоресценции

PBD – p21-связывающий домен

IC50 – половинная ингибиторная концентрация

Bcl-2 – B-cell leukemia/lymphoma 2, белок В-клеточной лейкемии/лимфомы 2

8

Bcl-XL – B-cell leukemia/lymphoma XL, белок В-клеточной лейкемии/лимфомы XL

Bad – Bcl2-associated agonist of cell death, ассоциированный с Bcl2 агонист клеточной гибели ГМГ-коА – 3-гидрокси-3метилглутарил коэнзим А

SIRT1 – протеиндеацетилаза Sirtuin1 GT I – геранилтрансфераза I

ТОФК – 5-тетрадецилокси-2-фуроевая кислота

9

Актуальность темы исследования и новизна работы

Нейрофиброматоз второго типа (НФ II) – аутосомно-доминантное наследственное заболевание, характеризующееся образованием множественных доброкачественных опухолей, преимущественно шванном и менингиом, локализующихся в центральной нервной системе и по ходу периферических нервов [1]. Несмотря на доброкачественную природу новообразований, заболевание часто приводит к летальному исходу вследствие формирования внутричерепных неоперабельных опухолей, нарушающих функции мозга. Медикаментозного лечения этой болезни не существует, более того, пациенты вынуждены подвергаться многократным хирургическим вмешательствам по удалению опухолей, что рано или поздно приводит к глухоте и слепоте.

Развитие заболевания связано с повреждением гена NF2 [1, 2]. С мутациями в этом гене связано как образование спорадических шванном и менингиом по всему телу, так и развитие опухолей, на первый взгляд не связанных с нейрофиброматозом, например, злокачественных мезотелиом.

NF2 проявляет себя как онкосупрессор, для его инактивации необходимо выключение обоих аллелей. Это предположение было сделано после того, как исследования показали, что пациенты с нейрофиброматозом II гетерозиготны по NF2, а в клетках опухолей, развивающихся у этих пациентов, обнаруживается биаллельное выключение NF2 [3].

Продукт гена NF2 – мерлин – гомологичен белкам эзрин-радиксин- моэзинового семейства, отвечающим за взаимодействие компонентов цитоскелета и клеточной мембраны [4]. Доказано, что мерлин взаимодействует с белками клеточной поверхности, белками, отвечающими за динамику цитоскелета, и белками, участвующими в ионном транспорте. В норме мерлин регулирует как пролиферацию, так и обусловленное актином движение клетки. Клетки, утратившие ген NF2, неспособны образовывать стабильные клеточные контакты.

Известно, что клетки, нокаутные по гену NF2, не испытывают контактного торможения клеточного роста, и, напротив, оверэкспрессия мерлина приводит к

10

угнетению пролиферации [5]. Не вполне ясно, каким образом мерлин регулирует клеточный рост, однако недавние исследования показали, что основными его мишенями являются р-21-активируемые киназы (РАК). В норме мерлин ингибирует р-21-активируемые киназы, а его утрата приводит к избыточной активации р-21-активируемых киназ с последующим запуском сигнальных путей, отвечающих за усиленный клеточный рост. Тем не менее, доподлинно неизвестно, насколько велик вклад активации р-21-активируемых киназ в изменения клеточного роста в NF2-/- клетках.

Мерлин участвует в регуляции множества сигнальных путей, включая активацию малых гуанозинтрифосфатаз (ГТФаз) семейства rat sarcoma-related C3 botulinum toxin substrate (RAC), взаимодействие с поверхностным антигеном кластера дифференцировки 44 (CD44), белком HRS (HGF-regulated kinase substrate, субстрат киназы, регулируемой гепатоцитарным фактором роста),

комплексом MTOR (mammalian target of rapamycin, белок-мишень рапамицина млекопитающих), фактором регуляции натрий-протонного обмена, спектрином βII и многими другими, однако функции мерлина до сих пор не ясны, а взаимодействия не изучены.

До сих пор не существует фармакотерапии нейрофиброматоза II типа. Пациенты вынуждены подвергаться многократным хирургическим вмешательствам, что снижает качество и продолжительность жизни. Таким образом, поиск лекарственнх веществ (ЛВ) для лечения нейрофиброматоза II типа является чрезвычайно актуальной задачей. Традиционный подход к решению этой задачи заключался в испытании зарегистрированных противоопухолевых препаратов на пациентах с нейрофиброматоза II типа и пока не привел к положительнрым результатам [6, 7]. Мы опробовали качественно иное решение задачи, а именно, провели скрининг коллекции биологически-активных соединений, относящихся к различным классам лекарственных веществ.

11

Цель исследования

Целью данной работы является поиск кандидатов для фармакотерапии нейрофиброматоза второго типа при помощи химического скрининга.

Задачи:

1)Модифицировать имеющуюся клеточную линию с высоким уровнем экспрессии Nf2, добиваясь нокаута Nf2.

2)Охарактеризовать полученную линию и сравнить ее с исходной – изогенной – линией, используя следующие критерии:

a морфологию b кривые роста

c устойчивость клеток к истощению среды

d устойчивость клеток к действию цитотоксических агентов.

3)Сравнить действие некоторых известных биологически активных молекул на изогенные Nf2-отрицательные и Nf2-положительные линии с целью определения веществ, избирательно действующих на NF2-/- клетки с помощью химического скрининга.

a провести скрининг коллекции низкомолекулярных биоактивных соединений (оценить соотношение выживаемости Nf2-отрицательных и Nf2- положительных клеток в присутствии исследуемых соединений)

b валидировать результаты скрининга:

•изучить зависимости концентрация/эффект для отобранных в скрининге соединений

•протестировать соединения-кандидаты на различных Nf2- отрицательных линиях

•оценить влияние реэкспрессии белка мерлин в Nf2- отрицательных клетках на эффект исследуемых веществ.

•протестировать фармакологические аналоги веществ, отобранных по результатам скрининга.

12

4)Определить механизм действия веществ-кандидатов, найденных в результате скрининга.

5)Проверить эффективность отобранных кандидатов in vivo.

Научная новизна работы

Работа содержит новые данные о селективных в отношении Nf2- отрицательных клеток ЛВ. Показана селективность ингибитора 3- гидроксиметилглутарил-коА редуктазы ловастатина и ингибитора синтазы жирных кислот церуленина в отношении Nf2-отрицательных клеток и описан механизм селективности действия данных соединений. Работа содержит новые данные о роли активации цитоплазматической фракции малой ГТФазы Rac1 в запуске клеточной гибели. Ранее были подробно описаны функции мембранной фракции Rac1, играющей важную роль в направленном движении клетки. Однако, есть лишь одна статья, демонстрирующая роль активированной Rac1 в цитоплазме [8]. В данной работе показано, что гиполипидемические препараты группы статинов, вызывая истощение внутриклеточного пула геранил-гераниола, переводят Rac1 из мембранной фракции в цитоплазматическую, а также, селективно активируют Rac1 в Nf2-отрицательных клетках, вызывая их гибель. Мы впервые описали синергизм между статинами и ингибитором геранилтрансферазы I.

Работа содержит данные о роли белка мерлин в регуляции метаболизма жирных кислот. Известно, что мерлин является одновременно онкосупрессором и регулятором актинового цитоскелета. Помимо стабилизации клеточных контактов организации актинового цитоскелета, мерлин отвечает за контактное торможение роста. Однако до сих пор не была показана связь белка мерлин с метаболическим сдвигом. Мы впервые показали, что скорость основных метаболических путей существенно повышена в Nf2-отрицательных клетках по сравнению с нормальными. В данной работе выявлены особенности метаболического сдвига в

13

Nf2-отрицательных клетках, и установлено, что благодаря этим особенностям ингибиторы синтазы жирных кислот, в частности, церуленин, обладают селективностью в отношении Nf2-отрицательных клеток.

Впервые предложены два возможных подхода к лечению НФ II: ингибирование 3-гидрокси-3-метилглутарил-коА редуктазы препаратами группы статинов и геранилтрансферазы I золедроновой кислотой; и ингибирование синтазы жирных кислот церуленином.

Практическая значимость диссертации

При отсутствии терапевтических средств для лечения НФ II в настоящее время активно ведется поиск и изучение ферментных каскадов, которые могут быть нарушены в результате утраты мерлина. В данной работе были обнаружены существенные изменения метаболического профиля Nf2-отрицательных клеток, а также, доказана необходимость нормального геранилирования ГТФазы Rac1 для выживания Nf2-отрицательных клеток. Таким образом, результаты работы позволяют рассматривать ингибиторы геранилтрансферазы I, 3-гидрокси-3- метилглутарил-коА редуктазы и синтазы жирных кислот в качестве новых потенциальных фармакологических веществ в лечении НФ II.

Апробация результатов диссертационной работы

Результаты работы были представлены на международных конференциях: “Cell Symposia: Systems Approach to Metabolic Diseases” (Чикаго, США, 2014), “The NF Conference 2013”, (Монтеррей Бэй, США, 2013), “18th Annual Postdoctoral and Graduate Student Conference” (Филадельфия, США, 2013), “The NF Conference 2011” (Джексон Хол, США 2011), “17th Annual Postdoctoral and Graduate Student Conference” (Филадельфия, США, 2011).

14

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общие представления о нейрофиброматозе II типа

Нейрофиброматоз второго типа (НФII) – аутосомно-доминантное наследственное заболевание, характеризующееся образованием множественных доброкачественных опухолей, преимущественно шванном и менингиом, локализующихся в центральной нервной системе и по ходу периферических нервов. Заболевание встречается с частотой примерно 1 на 33 – 40 тысяч [1]. НФII развивается при возникновении инактивирующих мутаций в онкосупрессорном гене NF2 [5]. Клинически заболевание проявляется формированием опухолей центральной нервной системы (ЦНС): вестибулярных шванном, внутричерепных менингиом, опухолей спинного мозга и его оболочек, эпендимом, глиом; и опухолей периферической нервной системы (ПНС) (рис. 1 – 3) [2, 9].

НФ II не обязательно сопровождается образованием фибром. Нейрофибромы скорее характерны для нейрофиброматоза I типа, при котором им обязательно сопутствуют пятна цвета кофе с молоком. При НФ II пятна

15

Рисунок 2 «Множественные менингиомы при НФ II»

Образование множественных менингиом (обозначены красными стрелками) типично для пациентов с НФ II. У 60% пациентов с НФ II обнаруживается хотя бы одна менингиома.

Рисунок 3 «Двусторонняя вестибулярная шваннома»

Шванномы VIII пары черепно-мозговых нервов обозначены красными стрелками. Белой стрелкой обозначена менингиома. Симметричное образование шванном на обоих нервах VIII пары является патогномоничным признаком НФ II.

Заболевание также всегда сопровождается аномалиями развития хрусталика [1, 10, 11], и сетчатки [10]. Патогномоничным признаком нейрофиброматоза II является развитие двусторонней вестибулярной шванномы (ВШ) – опухоли, растущей из шванновой оболочки черепных нервов VIII пары – причём билатеральную ВШ обнаруживают у 85% пациентов с НФ II [11-13]. Увеличение опухоли приводит к развитию сенситивной атаксии и глухоты. Односторонняя ВШ встречается у 5% пациентов [12]. У 60% пациентов обнаруживают как минимум одну внутричерепную или спинальную менингиому [14]. Эпендимомы обнаруживают в 5% случаев НФ II [12-15]. У 2% пациентов обнаруживают пигментацию по типу пятен цвета «кофе с молоком» – характерный симптом нейрофиброматоза I типа (болезни Реклингаузена), что вносит путаницу при постановке диагноза [12-15]. Несмотря на доброкачественную природу новообразований, заболевание часто приводит к летальному исходу вследствие

16

формирования внутричерепных неоперабельных опухолей, нарушающих функции мозга. Медикаментозного лечения этой болезни не существует, более того, пациенты вынуждены подвергаться многократным хирургическим вмешательствам по удалению опухолей, что рано или поздно приводит к глухоте и слепоте.

Причины развития НФ II. NF2 – «нетипичный» онкосупрессор

Развитие заболевания связано с повреждением гена NF2 [1, 2]. Мутации в этом гене вызывают как образование спорадических шванном и менингиом по всему телу, так и развитие опухолей, на первый взгляд не связанных с нейрофиброматозом, например, злокачественных мезотелиом.

Медицинские генетики относят НФ II к заболеваниям, наследуемым аутосомно-доминантным путем [1, 11]. Действительно, пациенты с НФ II гетерозиготны по гену NF2 и получают мутантный аллель от одного из родителей [16], однако для развития заболевания необходимо инактивирующее повреждение второго – нормального – аллеля, что соответствует механизму двухступенчатой инактивации Кнудсона [17]. Гомозиготы по мутантному NF2 погибают на доэмбриональной стадии развития до начала гаструляции [16, 18].

Высокий уровень экспрессии NF2 наблюдается в эмбриональном периоде; во взрослых организмах ген активен в шванновских клетках, клетках оболочек мозга, эпендимоцитах и эпителиоцитах хрусталика [19]. В спорадических шванномах и менингиомах в большинстве случаев обнаруживаются мутации в гене NF2 [20, 21], что доказывает, что инактивация этого гена ведет к неопластическому перерождению шванновских и лептоменингеальных клеток in vivo. Исследования позволяют предположить, что онкосупрессорная функция NF2 очень значительна: в 1999 г. Cheng et al. показал, что большая часть мезотелиом, вызванных асбестовой пылью, несут мутации в гене NF2 [3], также Fleury-Feith et al., 2003, показал, что у мышей, гетерозиготных по Nf2, при воздействии асбеста возникают злокачественные мезотелиомы, характеризующиеся потерей

17

гетерозиготности [22]. Более того, мутации или утрата NF2 наблюдаются в некоторых случаях меланомы, тироидной карциномы, гепатоцелюллярной карциномы и опухолей влагалищ периферических нервов [2, 23-25]. Мыши, гетерозиготные по Nf2, склонны к образованию остеосарком, фибросарком и гепатоцелюллярных карцином [12]. И наоборот, восстановление экспрессии Nf2 в опухолевых клетках тормозит или даже останавливает развитие опухоли [26]. Оверэкспрессия данного гена в нормальных клетках приводит к остановке клеточного цикла в G1 фазе [26].

Определение генетического дефекта, вызывающего развитие НФ II, неожиданно показало, что онкосупрессором в данном случае является белоккомпонент цитоскелета [4, 27]. До этого момента были известны «классические» онкосупрессоры, как, например, p53 и ретинобластомный белок Rb, - находящиеся в ядре и непосредственно контролирующие клеточный цикл [28]. Также, был описан ген NF1, негативно регулирующий промитотический сигнальный путь от RAS (rat sarcoma, онкогена крысиной саркомы) [28]. Однако продукт гена NF2, мерлин, или шванномин, как оказалось, не имеет каталитических или ДНК-связывающих участков, но обнаруживает существенную гомологию с белками моэзин-эзрин-радиксинового семейства [16].

Продукт гена NF2 – белок мерлин.

Мерлин, или шванномин, – новый представитель семейства Эзрин/Радиксин/Моэзин

Белки этого семейства обеспечивают взаимодействие компонентов актинового цитоскелета с цитоплазматической мембраной. До открытия мерлина считалось, что семейство образовано тремя отчетливо сходными (по сиквенсу) белками, которые впервые были выделены и затем исследованы Bretscher et al. в 1983-89 [29]. Эзрин (цитовиллин или p81) впервые выделили из микроворсинок

18

энтероцитов тонкого кишечника; в этих клетках он играет роль линкера между плазматической мембраной и актиновыми филаментами. Радиксин - актиномодулирующий белок, впервые выделенный из фракции межклеточных контактов (присутствует в опоясывающих десмосомах [30], а также десмосомах, присутствующих в кольце деления клеток животных). Моэзин - с одной стороны выявляется в филоподиях, а с другой - будучи встроенным в плазматическую мембрану выполняет функции одного из рецепторов гепараната, т.е. является гепарин-связывающим белком.

У белков этого семейства наиболее консервативным является NH2- концевой участок; степень гомологии - приблизительно 80% (рис. 4).

Рисунок 4 «Гомология белков эзрин-радиксин-моэзинового семейства»

В связи с очень высокой степенью гомологии этих белков их идентификация в клетке с помощью иммуноцитохимических методов была затруднена, однако в последнее время удалось надежно показать, что каждый из этих белков имеет в клетке вполне определенную локализацию, а также и то, что они все выступают как интегральные мембранные белки и играют существенную роль в ассоциации между актиновыми филаментами и плазматической

19

мембраной. Кроме того, они играют определенную роль во взаимодействиях "клетка-клетка" и участвуют в структуризации сайтов адгезии.

Продукт гена NF2 – мерлин – стал четвертым членом эзрин-радиксин- моэзинового семейства, предположительно, отвечающим за взаимодействие компонентов цитоскелета и клеточной мембраны. Как и другие белки этого семейства, он содержит высоко консервативный N-концевой FERM-домен, за которым следует суперспирализованный участок [4, 27]. У мерлина, в отличие от других представителей ERM-семейства, на С-конце нет актин-связывающей последовательности [16]. Предположительно, белки ERM-семейства существуют

вдвух конформациях: закрытой (неактивной) и открытой, обеспечивающей взаимодействие определенных плазматических рецепторов с актиновым цитоскелетом и регулирующей сигнализацию RHO-ГТФаз [16, 29, 31]. Фосфорилирование высококонсервативных сериновых остатков на С-конце и связывание фосфатидилинозитол(4,5)-бифосфата с FERM-доменом нарушают внутримолекулярные взаимодействия и переводят белки ERM-семейства из закрытой конформации в открытую [29]. Однако мерлин, находясь в открытой, фосфорилированной, конформации, способен образовывать гетеродимеры с другими членами семейства, а его закрытая форма участвует в подавлении пролиферации и, следовательно, должна считаться активной. Таким образом, мерлин ведет себя противоположно другим членам ERM-семейства [32]. Активация мерлина связана с дефосфорилированием серина Ser518 на С-конце молекулы [16]. Повышение уровня дефосфорилированного мерлина наблюдается

вклетках, испытывающих контактное торможение роста, при откреплении клеток от субстрата, в отсутствие факторов роста или при контакте клеток с гиалуроновой кислотой [33, 34], что доказывает, что мерлин собирает сигналы от множества различных ингибиторов роста.

20

Регуляция активности белка мерлин

Как уже было сказано выше, ключевым в регуляции активности мерлина является серин Ser518. Его фосфорилирование вызывает резкое увеличение подвижности молекулы и переход закрытой конформации в открытую [35-38], что подавляет супрессорную функцию мерлина [34]. Наиболее изучено фосфорилирование мерлина под влиянием малой ГТФазы Rac1 [36]. Посредником Rac-обусловленного фосфорилирования мерлина являются эффекторы Rac – р21активируемые киназы (Pak) – семейство серин-треониновых киназ, активируемых членом семейства малых ГТФаз – белком р21 [35, 37]

Существует также Pak-независимый путь фосфорилирования мерлина под влиянием протеинкиназы А (ПКА) [39]. Однако практически ничего не известно о фосфорилировании мерлина по другим аминокислотным остаткам. На N-конце молекулы инактивацию мерлина осуществляет фосфатидилинозитолбифосфат (PIP2), который связывается с высококонсервативными PIP2-связывающими сайтами [40].

Наиболее изученным активирующим воздействием на мерлин является его взаимодействие с миозин-фосфатазой MYPT1–PP1δ [41], которая способна дефосфорилировать Ser518 мерлина, тем самым вызывая его переход в активную закрытую конформацию. Миозин-фосфатаза MYPT1–PP1δ состоит из двух субъединиц: посадочной MYPT1, которая связывается с ближней к N-концу частью суперспирали мерлина, и киназной PP1δ [16]. В 2007 г. Ahronowitz et al. показал, что миссенс-мутация NF2, обнаруживаемая в клетках спорадических менингиом (L339F) препятствует связыванию MYPT1–PP1δ с мерлином, что, возможно, свидетельствует о необходимости этого взаимодействия для онкосупрессорной активности мерлина[17]. Это предположение подтверждается и тем фактом, что CPI-17, малый белок (17 kDa) – ингибитор фосфатаз, регулируемый протеинкиназой С, вызывает неопластическую трансформацию клеток in vitro в результате инактивации мерлина [41]. Повышение уровня CPI-17

21

в клетках панкреокарциномы и меланомы увеличивает способность этих клеток к опухолеобразованию in vivo [16]. Индуцированная экспрессия мерлина в мышиных эмбриональных фибробластах NIH3T3 ингибирует мерлин и активирует промитотический сигнальный путь RAS-ERK, в результате чего такие клетки приобретают способность расти в полужидком агаре и образовывать опухоли при подсадке бестимусным мышам [16]. Подобный же эффект оказывает аномальная активация РАК [16] – серин-треониновых неспецифических киназ, участвующих в организации актинового цитоскелета, и регулируемых белком р21

– представителем суперсемейства малых ГТФаз. Мутантная форма РАК с постоянной активностью нарушает контактное торможение роста в нормальных эндотелиальных клетках, поскольку фосфорилирует и, следовательно, ингибирует мерлин [42]. Также РАК способны фосфорилировать CPI-17 in vitro [43]. Если этот механизм работает in vivo, то РАК способны ингибировать MYPT1, а следовательно, и инактивировать мерлин.

Функции и локализация белка мерлин, взаимодействия с другими белками

Визуализация мерлина представляет определенные трудности в связи с низким уровнем эндогенного белка в большинстве клеток. Однако функции белка тесно связаны с его локализацией в клетке, поэтому многие исследователи предприняли попытки описать распределение экзогенного, оверэкспрессированного мерлина, несмотря на то, что такой подход может не вполне точно отражать реальную картину. Тем не менее, эти работы подтвердили гипотетические представления о мерлине как о белке, связывающем актиновый цитоскелет и клеточную мембрану. Мерлин скапливается в области плотных контактов, где он колокализован с моэзином [29]. В культуре клеток млекопитающих эндогенный и экзогенный мерлин сконцентрирован в участках клетки с наибольшей плотностью актиновых структур, как, например, складчатость мембраны или опоясывающие десмосомы [5, 31, 44] Известно, что клетки, утратившие ген NF2, перестают испытывать контактное торможение