диссертации / 90

41

Третью группу составили 17 пациенток, страдавших миомой матки, отобранные в гинекологическом отделении ГКБ № 55.

Четвертую группу составили 26 пациенток без гинекологической патологии («здоровые»), отобранные при очередном плановом гинекологическом обследовании в гинекологическом отделении ГКБ № 55.

Средний возраст пациенток в исследуемых группах был примерно одинаков – 41-47 лет.

2.2. Измерение концентрации сывороточного амилоида А и CA125

методом иммуноферментного анализа

Для определения концентрации амилоида А и CA125 и использовали спектрофотометр Labsystems Multiscan PLUS, Финляндия.

Для определения концентрации CA125 использовали набор для иммуноферментного анализа СА125 EIA (CanAg, Канада).

Для определения концентрации A-SAA использовали набор для иммуноферментного анализа Human SAA (Biosource, США). Анализ проводили в соответствии с протоколами производителя.

Для всех сывороток концентрацию A-SAA измеряли, как минимум, в двух повторах, а для высоких концентраций – в разных разведениях.

2.3. Профилирование сывороток с применением SELDI-TOF

Для профилирования сывороток использовали масс-спектрометр SELDITOF Protein Biology System II (PBS II) (Ciphergen, США).

Для оптимизации условий профилирования были использованы различные типы белковых чипов: NP20 (нормальнофазовые), SAX2 (сильные

42

анионообменники), WCX (слабые катионообменники), H4 (обращеннофазовые)

(Ciphergen Biosystems, США). Наилучшие спектры были получены при использовании чипов NP20.

2.4. Анализ масс-спектров

Анализ пиков масс-спектров проводили в пределах 5500 – 17500 Да. С этой целью была использована программа Biomarker Wizard™ (Ciphergen Biosystems)

со следующими настройками: соотношение сигнал/шум (первая ступень) 10,

соотношение сигнал/шум (вторая ступень) 5, пороговая интенсивность пика 0%,

допустимая ошибка в определении массы 0,2%.

2.5.Многофакторный анализ полученных данных

Сцелью статистической обработки материала исследования была сформирована база данных, введенных в таблицу MS Excel, включившая:

клинические сведения о пациентках исследуемой выборки, данные о концентрациях СА125 и A-SAA в их сыворотках крови, измеренные методом ИФА и данные масс-спектрометрии - значения интенсивностей 48 пиков,

идентифицированных с помощью программы Biomarker Wizard™.

Всю статистическую обработку материала проводили с помощью R языка,

находящегося в открытом доступе [www.r-project.org].

Для создания диагностического алгоритма были применены два метода классификации: метод опорных векторов (SVM) и метод логистической регрессии

(LR) [89].

Метод опорных векторов представляет собой метод распознавания образов

43

сучителем [45] и масс-спектров SELDI-TOF [64,70,112]. Основной целью метода опорных векторов является поиск наилучшего способа разделения множества исследованных сывороток на «раковые» и «не раковые». Перед применением метода опорных векторов был проведен отбор информативных признаков. Для этого применили алгоритм рекурсивного исключения признаков (Recursive Feature Elimination algorithm RFE, [45]. Сначала алгоритм применяли на всех данных, затем переменная, получившая наименьший вес, исключалась, и эту операцию повторяли, пока все переменные не были ранжированы в соответствии

спорядком их исключения. Затем отбирали тот набор признаков, который позволял добиться наилучшей точности классификации на всей исследуемой выборке.

Вкачестве альтернативы методу опорных векторов применяли метод логистической регрессии, который позволяет оценивать вероятность принадлежности исследуемого образца сыворотки крови больной раком яичников. Как и в методе опорных векторов, для улучшения модели предварительно проводили отбор признаков. Для отбора признаков использовали ступенчатую модель отбора, основанную на информационном критерии Акаике

(AIC), который позволяет достигнуть баланса между сложностью модели

(количеством входящих в уравнение регрессии переменных) и ее эффективностью для классификации.

Для проверки чувствительности и специфичности разработанных диагностических моделей использовали 10-кратную перекрестную проверку достоверности. При этом все имеющиеся образцы разделили на 2 группы. Первую группу использовали в качестве обучающей выборки для разработки диагностического алгоритма, а вторую группу - в качестве экзаменационной выборки для его проверки. 10-кратную перекрестную проверку достоверности

44

проводили по 100 раз для диагностических алгоритмов, полученных как методом опорных векторов, так и методом логистической регрессии. Для каждого диагностического алгоритма была вычислена чувствительность и специфичность с доверительными интервалами.

Сравнительно новым, простым и эффективным подходом к классификации является метод пар с наибольшим счетом (TSP) [93,110]. Этот метод основан на относительных, а не абсолютных интенсивностях пиков и позволяет получать правила классификации, которые легко интерпретировать. Как и метод опорных векторов, этот метод применим в случае, когда число исследуемых признаков очень велико. Реальные значения интенсивностей пиков внутри каждого профиля заменяли рангами. Затем выявляли такие пары пиков, у которых ранги в наибольшей степени различались между исследуемыми классами. Для обработки данных с помощью TSP и проверки эффективности модели путем перекрестной проверки на достоверность с исключением по одной пробе использовали программу, созданную разработчиками метода TSP и доступную на их сайте

(http://www.bme.jhu.edu/~actan/KTSP/) с неизмененными настройками.

Для анализа взаимосвязи между интенсивностью масс-спектрометричекого сигнала и концентрации амилоида А в сыворотке, измеренной методом иммуноферментного анализа, использовали ранговый коэффициент корреляции Спирмана, который позволяет выявлять нелинейные взаимосвязи.

45

Глава 3

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Клиническая характеристика

Первично материалом исследования явились клинические и морфологические данные 256 пациенток, находившихся на стационарном обследовании и лечении в гинекологических отделениях ГКБ № 55 и РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

Таблица№ 2

Количественный состав первично обследованных пациенток.

46

Учитывая строгие критерии отбора выборки для разработки метода протеомной диагностики , о которых упоминалось ранее, была сформирована исследуемая выборка (91 пациентка), подразделенная на четыре группы сравнения с учетом диагноза (таблица № 3).

Таблица № 3

Количественный состав исследуемой выборки пациенток с учетом диагноза

Все пациентки исследуемой выборки были русскими по национальности.

В первую группу отбирали только тех пациенток, у кого после проведенного хирургического вмешательства был гистологически верифицированный диагноз рака яичников и установлена стадия опухолевого процесса в соответствии с классификацией FIGO, 2009. Из 34 пациенток 27

47

(79,4%) страдали серозной аденокарциномой и 7 (20,6%) пациенток - муцинозной аденокарциномой. Из 34 пациенток 7 (20,6%) страдали раком яичников Iа-IIв

стадии (5 серозной и 2 муцинозной аденокарциномой) и 27 (79,4%) пациенток -

IIв-IV стадией рака яичников (22 серозной и 5 муцинозной аденокарциномой).

Во вторую группу были отобраны пациентки, у которых после хирургического вмешательства был гистологически верифицирован диагноз доброкачественной опухоли яичников. Из 14 пациенток у 9 (64,3%) была серозная

цистаденома яичника, у 2 (14,3%) - муцинозная цистаденома и у 3 (21,4%) -

зрелая тератома.

Третью группа составили 17 пациенток, страдавшие миомой матки,

подвергнутые хирургическому лечению по поводу больших размеров миомы матки (более 14 недель условной беременности) или менометроррагии,

приводящей к анемиии со снижением гемологлобина до 85 г/л. По

гистологическому строению все случаи миомы матки являлись лейомиомой.

Вчетвертую группу были отобраны 26 пациенток, обратившихся по поводу планового гинекологического обследования, которые в результате проведенного обследования были признаны здоровыми со стороны органов репродуктивной системы.

Ванамнезе всех пациенток исследуемой выборки не было отмечено никаких профессиональных и бытовых вредностей.

Из 91 пациентки 76 (83,5 %) являлись служащими, 15 (16,4%) –

домохозяйками. Из вредных привычек следует отметить курение (наибольшее количество курящих было в группе пациенток, страдавших раком яичников и миомой матки). 22 (24,1%) отметили в анамнезе аллергию (9 - пищевую и 13на различные группы антибиотиков), 39 (42,8%) пациенток отметили наличие родственников с онкологическими заболеваниями в семейном анамнезе, причем

48

из 34 пациенток, страдавших раком яичников, онкологически отягощенный анамнез был у 9 (26,3%) пациенток.

Анализ перенесенных соматических заболеваний у пациенток исследуемой выборки представлен в таблице № 4.

Таблица № 4

Перенесенные заболевания в анамнезе пациенток исследуемой выборки

49

Продолжение таблицы №4

*р<0,003 достоверные различия между контрольной группой и группами исследования.

Как можно видеть в таблице № 4, из детских инфекций наиболее часто в

анамнезе пациенток в каждой группе отмечались перенесенные инфекционные

заболевания, в частности, ветряная оспа и краснуха. Частота детских

инфекционных и острых респираторных вирусных заболеваний была выше в группе пациенток, страдавших раком яичников.

Патология желудочно-кишечного тракта и гипертоническая болезнь также превалировала (44,0% и 44,1%, соответственно) в анамнезе пациенток, страдавших раком яичников по сравнению с другими группами. У всех пациенток гипертоническая болезнь была медикаментозно компенсированная, без поражения органов мишеней.

У пациенток, отметивших сахарный диабет в анамнезе, при обследовании был подтвержден диагноз инсулиннезависимого сахарного диабета второго типа. Уровень глюкозы натощак не превышали 6,0 ммоль/л.

Степень ожирения оценивали по индексу массы тела (отношение веса в килограммах к росту в метрах, возведенное в квадрат) – таблица № 5.

50

Таблица № 5

Средний индекс массы тела у пациенток исследуемой выборки

р<0,003 достоверные различия между контрольной группой и группами исследования.

Из таблицы № 5 следует, что наиболее высокий индекс массы тела наблюдался в группе пациенток с миомой матки. В группе пациенток, страдавших раком яичников, доброкачественными опухолями яичников и здоровых индекс массы тела варьировал в пределах референсных значений (20–25).

Вэтой же группе была отмечена высокая частота (52,9%) варикозной болезни нижних конечностей.

Втаблице № 6 представлены данные репродуктивного анамнеза пациенток исследуемой выборки.