диссертации / 90

31

хроматографическое фракционирование биологической жидкости перед масс-

спектрометрическим анализом. В результате полученные спектры содержат более или менее хорошо разрешенные пики. Применение масс-спекрометрии SELDITOF началось с разработки компьютерных методов классификации спектров,

рассматриваемых как «черные ящики», то есть без идентификации биомаркеров, и

в первых же работах были достигнуты высокие значения чувствительности и специфичности диагностики [58,83]. В других работах некоторые дискриминаторные пики были идентифицированы [59,75,84].

Метод SELDI-TOF имеет очень высокую производительность. В течение дня могут быть проанализированы десятки образцов. Кроме того, процедура может быть автоматизирована, и тогда производительность повышается еще во много раз. В качестве биологического материала для исследования с помощью

SELDI-TOF могут быть использованы, как биологические жидкости (плазма крови, моча), так и белковые экстракты из тканей. Технологию SELDI-TOF можно использовать как альтернативу двумерному электрофорезу для поиска биомаркеров и их дальнейшей идентификации [83].

Возможен также другой подход. Так как процедура получения спектров достаточно проста, при использовании плазмы или сыворотки крови спектры можно применять не только в качестве объекта исследования, но и как диагностический признак [86,87].

Несмотря на множество преимуществ технологии SELDI-TOF, реальные ее возможности являются предметом ожесточенных дискуссий в научном сообществе. Одной из основных проблем является присутствие в сыворотке больших концентраций мажорных белков (например, альбумина). По сравнению с ними концентрации большинства кандидатных маркеров, вероятнее всего,

ничтожны. К сожалению, реальные пределы чувствительности метода при работе не с изолированными белками, а со сложной смесью, такой как сыворотка, еще не

32

определены. На данном этапе технология SELDI-TOF широко применяется для разработки диагностики различных видов рака, оставаясь при этом в значительной степени эмпирическим методом [37,38].

Для разработки адекватного диагностического метода большое значение имеет правильный подбор выборок. Достоверность и универсальность результатов во многом определяется именно этим. Прежде всего, не должно быть статистически значимых отличий между сравниваемыми выборками по другим признакам, кроме наличия или отсутствия болезни [106]. Для этого во всех исследованиях используют сыворотки крови пациентов с впервые диагностированным раком, еще не проходивших никаких курсов лечения, так как результаты лечения сами по себе могут существенно отразиться на структуре белка. Исследуемые группы не должны заметно различаться по среднему возрасту, иначе найденные отличия могут быть следствием не болезни, а

возрастных изменений. Другим источником систематических отличий могут быть различия в методиках получения или хранении образцов сыворотки вследствие того, что контрольные сыворотки получены из другого источника, чем сыворотки больных раком [106].

1.5. Характеристика сывороточного амилоида А

Из всех биомаркеров, идентифицированных с использованием масс-

спектрометрических методов, наибольший интерес вызывает сывороточный амилоид А, так как, по последним данным, он может оказывать непосредственное влияние на развитие опухоли. Сывороточный амилоид А острой фазы (A-SAA)

впервые был обнаружен как растворимый предшественник амилоида А – белка,

образующего амилоидные накопления при хроническом воспалении [91].

Концентрация A-SAA в крови при воспалении повышается до 1 мг/мл и более при

33

норме 1–10 мкг/мл [97].

Известно, что концентрация A-SAA повышается при инфекционных заболеваниях бактериальной и вирусной природы, остром панкреатите [85],

инфаркте миокарда [30], после ожогов [30]. В большинстве случаев повышенный уровень сывороточного амилоида А коррелирует с тяжестью протекания и неблагоприятным исходом заболевания [30,72].

Семейство сывороточных амилоидов А (SAA) включает в себя несколько гомологичных белков с молекулярной массой 11–12 кДа. У человека существует два почти идентичных гена, кодирующих A-SAA: SAA1 и SAA2. Гены SAA1, так и

SAA2 представлены несколькими аллельными вариантами [97]. Еще один ген,

относящийся к семейству сывороточного амилоида острой фазы, SAA3, у человека содержит инсерцию, приводящую к сдвигу рамки считывания и появлению стоп-

кодона. Тем не менее, было показано, что в ответ на стимуляцию пролактином или индуктором воспаления LPS наблюдается транскрипция SAA3 в

эпителиальных клетках молочной железы. Однако появления продукта трансляции этой мРНК не было обнаружено [61].

Помимо белков острой фазы, к семейству сывороточных амилоидов А относятся также конститутивные белки (C-SAA). У человека семейство C-SAA

включает один белок SAA4, уровень экспрессии которого более или менее постоянен. SAA4 обладает идентичностью аминокислотной последовательности около 50% с белками острой фазы A-SAA [97].

Уже несколько десятилетий назад было замечено повышение уровня A-SAA

в крови у больных раком яичника [91], раком простаты [53] и раком толстой кишки [43]. Более того, уровень A-SAA коррелирует со стадией заболевания и достигает наибольших значений на стадии образования метастазов [26,53].

34

Недавно было проведено исследование уровня A-SAA при раке желудка, и

обнаружена тенденция к увеличению концентрации A-SAA в сыворотке при увеличении размера и стадии опухоли. Через месяц после операции концентрация

A-SAA достигала уровня, характерного для здоровых индивидуумов

(0,0034±0,0028 г/л). Позже повышение концентрации A-SAA (0,17±0,6 г/л)

свидетельствовало о наличии рецидива, при этом новым очагом опухоли могли служить различные органы: печень, лимфоидная ткань, кость [31].

Неоднократно исследовали влияние повышенной концентрации A-SAA на прогноз заболевания. Было показано, что для больных раком на поздней стадии при концентрации A-SAA выше 0,01 г/л средняя продолжительность жизни существенно меньше, чем при концентрации A-SAA ниже 0,01 г/л [26].

По данным Chan и соавторы, у пациентов с концентрацией A-SAA более

0,097 г/л риск летального исхода увеличивался почти в 4 раза. Эти наблюдения свидетельствует в пользу того, что повышенный уровень A-SAA может оказывать влияние на прогрессию злокачественной опухоли [31].

При использовании протеомных методов поиска биомаркеров A-SAA был выявлен как один из потенциальных биомаркеров рака яичника [75], легких

[41,68], почки [39,97], носоглотки [32].

A-SAA был идентифицирован в качестве маркера метастазирования аденокарциномы простаты в костную ткань [62]. Для рака легкого показано прогрессирующее увеличение концентрации A-SAA с прогрессированием рака.

При этом показано, что после операции или химиотерапии уровень A-SAA

снижается [69].

Сначала считалось, что A-SAA у пациентов со злокачественными опухолями синтезируется в печени, и повышение его концентрации в крови является следствием системного ответа организма на сопутствующее злокачественной опухоли воспаление. Однако для рака толстой кишки было

35

показано, что повышенная экспрессия A-SAA наблюдается в опухолевой ткани

[44]. Повышенная экспрессия A-SAA была также обнаружена в клетках хориокарциномы и в трофобласте первого триместра беременности [57]. В то же время для рака желудка иммуногистохимическое окрашивание показало наличие

A-SAA в основном в кровеносных сосудах, а не непосредственно в опухолевых клетках [31].

Связь A-SAA c разнообразными заболеваниями человека, включая ревматоидный артрит, атеросклероз и злокачественные опухоли, привлекла к нему внимание специалистов. Данные о свойствах A-SAA, накопленные в последние годы, позволяют предположить, что этот белок может играть активную роль в патогенезе упомянутых заболеваний. К настоящему времени накоплено большое количество разносторонней информации о взаимодействиях белка A- SAA с различными белками-партнерами и их последствиях. A-SAA оказывает влияние на воспалительный процесс, индуцирует экспрессию ряда матриксных металлопротеиназ, изменяет липидный метаболизм, взаимодействует с межклеточным матриксом. Наибольший интерес вызывает способность A-SAA

активировать экспрессию транскрипционного фактора NF-kB и матриксных металлопротеиназ [48,52,65,66,76,101].

Способность A-SAA стимулировать пролиферацию клеток, ингибировать апоптоз, а также стимулировать ангиогенез была напрямую продемонстрирована на синовиоцитах больных ревматоидным артритом. Доказано, что за реализацию этих свойств отвечает рецептор FPRL1. Следует отметить, что патологические процессы, характерные для ревматоидного артрита, имеют много общего с развитием злокачественной опухоли [66].

На основании вышесказанного можно предположить, что A-SAA при злокачественных опухолях не является просто маркером воспаления, а тесно взаимосвязан с процессом опухолевой трансформации. Кроме того, A-SAA имеет

36

еще ряд важных для потенциального маркера преимуществ. Во-первых, его концентрация в сыворотке в норме в 10-100 раз ниже, чем у других кандидатных маркеров. Во-вторых, при болезни концентрация A-SAA увеличивается в 100 и

более раз, тогда как концентрация других маркеров, выявленных масс-

спектрометрическими методами, меняется сравнительно слабо [44,57].

37

Глава 2

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на кафедре акушерства и гинекологии № 1 лечебного факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова (клиническая база ГКБ № 55) совместно с лабораторией диагностической протеомики Государственного учреждения «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» РАМН.

2.1. Принципы сбора и объем материала исследования

Материалом исследования явились клинические и морфологические данные 256 пациенток, находившихся на стационарном обследовании и лечении в гинекологических отделениях ГКБ № 55 и их сыворотки крови.

При поступлении в стационар все пациентки были обследованы по стандартному плану, включая:

1.Сбор анамнеза с учетом паспортных данных, национальности, постоянного места жительства, профессиональных и бытовых вредностей, вредных привычек, особенностей питания, семейного анамнеза, репродуктивного анамнеза, перенесенных заболеваний. При изучении анемнестических данных учитывали детальный анализ перенесенных и сопутствующих экстрагенитальных и гинекологических заболеваний. Тщательному анализу подвергнут характер менструального цикла с учетом таких показателей, как возраст менархе, особенности становления менструальной функции, длительности и обьема кровопотери. Репродуктивная функция оценивалась по возрасту начало половой жизни, количеству беременностей, их течению и исходу.

38

2.Физикальное исследование органов малого таза и молочных железы.

3.Лабораторные исследования (общий и биохимический анализ крови, общий анализ мочи, определение уровня СА125).

4.Инструментальные исследования: УЗ-томография органов малого таза и брюшной полости, маммография, рентгенография органов грудной клетки.

5.Эндоскопическое исследование органов желудочно-кишечного тракта,

включая ирригоскопию и эзофагогастроскопию проводилось у всех пациенток с новообразованиями яичников для исключения патологии желудочно-кишечного тракта (при невозможности применяли рентгенологические методы исследования желудка и двенадцатиперстной кишки).

6.Далее обследование пациенток расширялось в пределах, необходимых для постановки диагноза компьютерная томография и магнитно-резонансная томография выполнялись у пациенток с распространенным о пухолевым процессом для верификации метастазирования.

натощак до начала любого вида лечения. Затем производили отделение сыворотки от форменных элементов крови. Образцы инкубировались при комнатной температуре (18-20 С) в течение 30-40 минут до полного образования сгустка.

После ретракции сгустка пробы центрифугировали в течение 10-15 минут, затем сыворотку сливали во вторичные пробирки и маркировали. Полученные пробы

39

замораживали и хранили при температуре -70 С до получения гистологического заключения.

Как уже упоминалось в главе 1, выборки, используемые для разработки адекватного метода протеомной диагностики рака, должны соответствовать строгим требованиям [106]:

1.Отсутствие статистически значимых отличий между сравниваемыми группами, кроме признака наличие или отсутствие болезни.

2.Контрольная выборка должна включать в себя не только здоровых лиц, но и лиц, страдающих доброкачественными опухолями и неонкологическими заболеваниями.

3.Отсутствие различий в среднем возрасте, иначе найденные отличия могут быть следствием не болезни, а возрастных изменений.

4.Отсутствие различий в методиках получения и хранения образцов сывороток крови между сравниваемыми группами.

Сообразуясь с указанными требованиями, в наше исследование были

отобраны 4 группы пациенток:

1.Больные раком яичников – основная группа.

2.Больные доброкачественной опухолью яичника – контроль.

3.Больные миомой матки – контроль.

4.Здоровые женщины – контроль.

40

Критериями отбора пациенток в исследуемую выборку явились:

1.Единообразие этнической принадлежности.

2.Гистологически верифицированный диагноз.

3.Возраст – по типу «случай-контроль».

После верификации диагноза из 256 пациенток была сформирована исследуемая выборка, включившая 91 пациентку с учетом критериев отбора (таблица № 1).

Таблица № 1

Исследуемая выборка пациенток

Как видно в таблице № 1, основную группу составили 34 пациентки, страдавшие раком яичников.

Вторую группу составили 14 пациенток, страдавших доброкачественными новообразованиями яичников, отобранные в гинекологическом отделении ГКБ №

55.