диссертации / 73

В 9 серии устанавливали влияние анизотропии на результаты пластики гры-

жевых дефектов с использованием протезов, приближенных по механическим свойствам к укрепляемым фасциальным структурам.

В10 серии опытов in vitro определяли роль биомеханических взаимодействий

впреждевременном старении и разрушении материала сетчатого протеза.

2.2 Экспериментальные модели и порядок проведения исследований.

Содержание животных осуществлялось в соответствии с требованиями,

утвержденными этическим комитетом РНИМУ им. Н.И. Пирогова и международ-

ным регламентом “The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”, опубли-

кованным the National Institute of Health. Во всех сериях, где оперировали живот-

ных, производили стандартную подготовку к опыту и применяли рекомендуемые ветеринарами методики наркоза.

За сутки перед операцией у лабораторных животных убирали корм и остав-

ляли только воду. Перед введением в наркоз ассистент взвешивал крысу и удержи-

вал ее руками в специальных плотных перчатках. Оператор производил в/м инъек-

цию смеси золетил 50 и ромпуна 2% (ксилазин гидрохлорид), приготовленную из расчета 10 мг/кг золетил 50 и 0.05 мл/кг ромпун. В большинстве случаев одной инъекции было достаточно для поддержания наркоза на протяжении всей опера-

ции. В редких ситуациях дополнительно в/м вводили 0.1 – 0.2 мл смеси. Кроликов также сначала взвешивали, а затем помещали в специальный бокс, где производили в/м инъекцию смеси из золетила 50 и ромпуна, приготовленную из расчета 6 мг/кг золетил 50 и 0.05 мл/кг ромпун. После этого устанавливали катетер в ушную вену и поддерживали необходимую глубину наркоза дробным введением, ориентируясь на частоту дыхания и глазные рефлексы. Перед операцией животных фиксировали текстильными лентами в специальных станках. Операционное поле широко и тща-

тельно выбривали, обрабатывали спиртом и отграничивали стерильными салфет-

ками.

61

В раннем послеоперационном периоде животные не нуждались в обезболи-

вании. На следующие сутки после операции животные были активны и могли са-

мостоятельно принимать пищу и пить воду, что свидетельствовало об отсутствии болевых ощущений. Контроль состояния животных осуществлялся ежедневно в те-

чение всего срока пребывания их в виварии.

Выведение животных из опыта осуществлялось под наркозом путем внутри-

венного или внутрисердечного введения высокой дозы 4% раствора хлорида калия.

Утилизация биологического материала и трупов животных производилась в соот-

ветствии с установленными в виварии РНИМУ правилами.

В 1-я серии у 36 крыс-самцов породы Вистар весом 290 – 300 г производили срединный разрез кожи и подкожно с обеих сторон имплантировали сетки

Mersilene размером 2 х 3 см. Образцы предварительно инкубировали в течение 30

минут в одном из растворов. Для приготовления растворов использовали следую-

щие агенты и концентрации:

доксициклин (20 мг/ml, Doxycyclin-ratiopharm, Ratiopharm, Ulm, Germany),

ТРФ-бетта 3 (TGF-beta 3, 0.1 г/мл, SigmaAldrich, Steinheim, Germany),

цинк-гидрогенаспартат (3 мг/мл, Unizink, Koehler-Pharma, Aisbach, Germany),

аскорбиновая кислота (10 мг/мл, Canea Pharma, Hamburg, Germany),

гиалуроновая кислота (10 мг/мл, Sigma-Aldrich).

Образцы, инкубированные в физиологическом растворе, служили контролем. Че-

рез 7 и 90 дней после имплантации по 3 животных из каждой группы использова-

лись для взятия материала на гистологическое исследование. В гистологических срезах измеряли содержание коллагена по отношению к белку и оценивали соот-

ношение I/III типа коллагенов.

Во 2-серии 24 кролика-самца породы Шиншилла весом 4 – 4.5 кг рандоми-

зированно разделили на две группы по 12 животных. В одной группе сетки имплан-

тировали по способу sublay, а в другой – по способу onlay (рис. 4).

62

В Г

Рис. 4. Надфасциальное (А, Б) и ретромускулярное (В, Г) расположение протеза.

Для этого в каждой группе у 6 животных использовали частично рассасыва-

ющуюся сетку Ultrapro (удельный вес полипропилена 33 г/м2) и стандартный поли-

пропиленовй протез Prolene (82 г/м2). В группе sublay производили кожный разрез длиной 6 см и лапаротомию протяженностью 4 см. После этого с обеих сторон вы-

деляли задние листки и сшивали их Prolene 4-0. На задний листок укладывали про-

тез размером 6 х 5 см, фиксировали его по периферии к мышцам и над протезом послойно ушивали рану. В группе onlay производили кожный разрез и лапарото-

мию, соответственно, длиной 6 и 4 см. После этого ушивали фасции и на передний листок укладывали протез размером 6 х 5 см, который по краям фиксировали к мышцам. Несколькими швами сопоставляли подкожно-жировую клетчатку и накладывали отдельные швы на кожу. Все сетки располагали петельными столби-

ками поперек средней линии или максимальной жесткостью в направлении боко-

вых мышц. Через 60 дней после операции животных выводили из опыта. Вырезан-

63

ные из передних брюшных стенок препараты, включающие протез вместе с мы-

шечно-фасциальными тканями фиксировали в 10% раствор формалина, делили на несколько частей, помещали в парафиновые блоки и проводили гистологические исследования с целью измерения размера гранулем, определения уровня металло-

протеиназ (MMP-2) и оценки соотношения I/III типов коллагена.

В 3-серии 18 кроликам-самцам весом 3-3.5 кг имплантировали 3 типа легких протезов с разной трикотажной структурой. В соответствии с типом имплантиро-

ванного протеза животных разделили на 3 группы (n=6). Сетчатые протезы разме-

ром 6 х 5 см (Д х Ш) укладывали под мышцы на задний листок петельными стол-

биками вдоль средней линии и фиксировали по периметру непрерывным швом. Че-

рез 3 месяца после операции животных выводили из опыта. ПБС переносили на матовое стекло просмотрового столика и методом компьютерной планиметрии определяли длину, ширину и площадь имплантата. Далее из ПБС в продольном и поперечном направлении вырезали по одной полоске размером 35 х 20 мм, из ко-

торой извлекали сетку вместе со слоем соединительной ткани и на разрывной ма-

шине испытывали на прочность. Гистологические срезы окрашивали по ван Ги-

зону. Методом морфометрии измеряли толщину сформировавшегося слоя, опреде-

ляли соотношение соединительной и жировой ткани в крупных порах, а также пар-

циальное содержание зрелой соединительной ткани в области узловых соединений нитей.

В 4-й серии исследовали структурные параметры и механические свойства у

12 хирургических сеток. Все выбранные хирургические сетки являлись трикотаж-

ными материалами, изготовленными из монофиламентных синтетических нитей.

При этом из 8 протезов сформировали 4 технологические пары: Parietene Standard

–Parietene light, Premilene – Optilene LP, Dyna Standard – Dyna Light, Esfil Standard

–Esfil Light. В каждой паре протезы были изготовлены на основе одного вида три-

котажного переплетения, но отличались по материалоемкости и были разделены на стандартные и легкие. Сравнительные исследования структуры и механических свойств были дополнены широко используемыми в практической хирургии двумя сетками от компании Ethicon – Prolene и Ultrapro. Кроме того, были изучены еще

64

две сетки – это Uniflex, изготовленная из PVDF нитей, и Surgimesh, обладавшая структурой с повышенной жесткостью.

В 5-ой серии провели сравнительное исследование анатомии ПБС и механи-

ческих свойств фасций у крысы, кролика и человека. После эвтаназии у 6 крыс-

самцов породы Вистар весом 450 – 510 г и 4 кроликов-самцов весом 3.5 – 3.7 кг вдоль белой линии широко рассекали кожу, с обеих сторон кожу с подкожно-жи-

ровой клетчаткой отделяли от мышц и фасций и послойно препарировали мышцы и фасции (рис. 5).

А Б

Рис. 5. Препарирование передней брюшной стенки крысы.

А – наружная косая мышца отведена кнаружи. Б – прямая мышца живота отсечена внизу и отведена вверх.

От наружного края переднего листка отсекали наружную косую мышцу и от-

крывали сначала внутреннюю косую мышцу, а затем поперечную. После этого вскрывали влагалище прямой мышцы живота в области разделения апоневроза внутренней косой мышцы на передний и задний фасциальные листки. Тупым и ост-

рым путем отделяли от прямой мышцы передний листок, а затем преимущественно тупым путем отделяли прямую мышцу от заднего листка. Аналогично выделяли оба фасциальных листка, с другой стороны. В поперечном направлении ниже linea arcuata полностью пересекали передний листок, который на этом уровне состоял из всех фасций и не имел сращений с прямой мышцей. Слегка натягивали отсеченный апоневроз в каудальном направлении и глазными ножницами разрезали волокна белой линии, которые соединяли передний и задний листок, от linea arcuata до ме-

65

чевидного отростка. Оба листка последовательно помещали на препаровочный столик и в мезогастральной области вырезали по одной пробе вдоль и попрек белой линии размером 6-8 мм в ширину и 14-15 мм в длину. С помощью цифрового толщиномера измеряли их толщину, после чего проводили их испытания на растяжение до разрыва. Кроме того, дополнительно использовали 2-х крыс и 2-х кроликов, у которых производили поперечные срезы ПБС выше пупочного кольца для проведения сравнительных исследований с ПБС человека. Для сравнения анатомических особенностей строения ПБС человека и животных были использованы данные из научных статей и атласа анатомии человека под редакцией Синельникова Р.Д. и Синельникова Я.Р.

Взятие трупных фасций человека для механических испытаний производилось в судебно-медицинском морге №2 после согласования протокола исследований на кафедре судебной медицины РНИМУ им. Н.И. Пирогова с профессором Буромским И. В. Образцы фасций передней брюшной стенки человека взяли у 4 мужских и 4 женских трупов. Возраст погибших находился в пределах 30 – 60 лет, время после смерти не превышало 2 суток. У каждого трупа от мышц передней брюшной стенки отделяли кожу вместе с подкожно жировой клетчаткой и брюшину с предбрюшинным жиром. В мезогастральной области с обеих сторон от белой линии иссекали по одной полоске размером 60 х 30 мм из наружного и внутреннего листков апоневроза прямой мышцы живота. С одной стороны, вырезали полоски вдоль белой линии, а с другой поперек. Образовавшиеся дефекты ушивали несколькими отдельными швами.

6-серия состояла из двух этапов, в которых разрабатывали оптимальную методику воссоздания грыжевого дефекта для тестирования сетчатого протеза.

На первом этапе использовались две методики моделирования грыжи, при которых производилось вскрытие брюшной полости. В 3-х группах (n=3) после срединной лапаротомии у крыс-самцов весом 290 – 320 г производили ушивание фасций на катетерах трех разных диаметров 2.4, 4.8 и 7.2 мм. В 4-ой группе (n=8) в мезогастральной области иссекали прямые мышцы, и к краям раны подшивали большой сальник. Через 28 дней животных выводили из опыта и производили

66

осмотр с наложением пневмоперетонеума. После чего вводили теплый раствор ба-

рия в желатине в аорту для контрастирования сосудистой сети передней брюшной стенки. ПБС вырезали и фиксировали в концентрированном соляном растворе. Для рентгенологического исследования использовали аппарат для маммографии.

На втором этапе была разработана методика создания дефекта без вскрытия брюшной полости у двух видов лабораторных животных: кроликов и крыс.

У 5 кроликов-самцов породы Шиншилла весом 3.5 – 3.8 кг под общим обез-

боливанием рассекали кожу ПБС на 2 см латеральнее средней линии и выделяли наружные листки влагалища прямой мышцы живота. Далее с обеих сторон произ-

водили отсечение прямых мышц живота от белой линии на протяжении 4 – 5 см и отделение от внутренних листков апоневроза. После этого частично резецировали мобилизованные медиальные края прямых мышц и формировали дефект размером

3 х 4 см. Операцию заканчивали сшиванием кожи и подкожной клетчатки отдель-

ными узловыми швами. Кожный шов располагался в стороне от дефекта и не во-

влекался в процессе заживления в рубец (рис. 6).

А Б

Рис. 6. Создание срединного грыжевого дефекта у кролика. А – частично иссечены прямые мышцы. Б – наложены швы на кожу.

В ближайшем послеоперационном периоде проводили короткий курс анти-

бактериальной терапии. В дальнейшем осуществляли еженедельный осмотр и кон-

троль области дефекта до появления грыжевых образований. Через 2 месяца жи-

вотных повторно наркотизировали и обследовали. В условиях пневмоперитонеума под давлением 4 – 5 мм Hg ст. определяли наружные размеры грыжевого выпячи-

67

вания и размеры грыжевого кольца, производили фотосъемку и выводили живот-

ных из опыта. Гистологические срезы из области грыжевого мешка и кольца окра-

шивали гематоксилином и эозином и сириусом красным. При световой микроско-

пии определяли качественный состав соединительной ткани, а с помощью кросс-

поляризационной микроскопии оценивали соотношение типов коллагена.

У 5 крыс-самцов породы Вистар весом 440 – 480 г под общим обезболива-

нием рассекали кожу вдоль средней линии и выделяли наружные листки влагалища прямой мышцы живота. С обеих сторон от белой линии отсекали прямые мышцы живота на протяжении 50 мм и отделяли задний листок. Затем полностью удаляли белую линию, частично резецировали медиальные края прямых мышц живота и формировали дефект размером 16-18 мм в ширину и 26-28 мм в длину (рис. 7).

Рис. 7. Создание грыжевого дефекта у крыс.

Через 2 месяца под наркозом проводили грыжевой тест, для чего в брюшную полость устанавливали катетер и вводили физиологический раствор с шагом в 2-3

мм Hg ст., повышая ВБД до 15 мм Hg ст.. После теста животных выводили из опыта. Пробы-полоски для гистологического исследования вырезали в поперечном направлении от средней линии до края дефекта. Гистологические срезы окраши-

вали по Ван-Гизону и гематоксилином и эозином.

При исследовании биосовместимости сетчатых протезов, чтобы сократить сроки эксперимента, модель грыжи, которую создавали у крыс, модифицировали.

Формирование грыжевого дефекта и его пластику по способу sublay выполняли од-

номоментно. Для этого сначала мобилизовывали наружные и внутренние листки апоневроза. Затем после частичной резекции прямых мышц в сформированное

68

межфасциальное пространство укладывали протез размером 40 х 30 мм, края кото-

рого по периметру фиксировали к мышцам ПБС непрерывным швом Prolene 4.0.

Со всех сторон имплантат перекрывал дефект не менее чем на 6 мм (рис. 8). Над протезом тонкой рассасывающейся нитью (Викрил или Дексон 6-0), наложив не-

сколько непрерывных швов, сопоставляли листки наружного апоневроза.

Рис. 8. Пластика грыжевого дефекта по способу sublay.

После операции антибиотикотерапия не проводилась, в течение 6 месяцев все животные содержались в стандартных условиях. Через 6 месяцев после импланта-

ции исследовали механические свойства протезированной ПБС, изменения в струк-

туре сеток, воспалительный ответ и состав соединительной ткани.

В 7 серии провели сравнительные исследования биосовместимости 4-х стан-

дартных сетчатых ПП протезов (с близкой материалоемкостью), изготовленных на основе 4 видов трикотажных переплетений: Premilene (атлас), Esfil Standard (трико-

атлас), Prolene (трико-сукно) и Parietene Standard (филейное атлас). У 24 крыс-сам-

цов весом 410 – 460 г породы Вистар, разделенных на 4 группы (n=6), производили замещение миофасциального дефекта исследуемыми протезами, которые распола-

гали петельными столбиками вдоль средней линии. Через 6 месяцев после имплан-

тации хирургических сеток животных выводили из эксперимента. В брюшную по-

лость устанавливали два катетера и плавно повышали внутрибрюшное давление до

30 мм Hg ст. для проверки состоятельности передней брюшной стенки (грыжевой тест). После теста по периметру вскрывали брюшную полость и определяли коли-

чество абдоминальных спаек, связанных с имплантатом и наличие осложнений. За-

69

тем ПБС иссекали и переносили на предметный столик стереомикроскопа. При сте-

реомикроскопии в проходящем свете определяли площадь дефекта, заполнение со-

единительной тканью структуры протезов, характер сосудистого рисунка и сохран-

ность трикотажной структуры. При гистологическом исследовании поперечных срезов, окрашенных гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону, оценивали выражен-

ность воспалительной реакции, клеточный состав воспалительных инфильтратов и качество соединительной ткани.

В 8 серии изучили тканевой ответ на структуру и биомеханические взаимо-

действия у протезов с модифицированной трикотажной конструкцией, изготовлен-

ных на основе переплетений атлас и трико-атлас. В группе атлас исследовали стан-

дартную сетку Surgimesh, структура которой при изготовлении подвергалась жест-

кой термопластической обработке, и облегченную конструкцию Optilene LP. В

группе трико-атлас исследовали стандартную сетку Uniflex, изготовленную из ПВДФ нитей, и сетку Esfil Light с уменьшенной материалоемкостью.

У 20 крыс-самцов весом 430 – 470 г формировали срединный миофасциаль-

ный дефект и закрывали его по способу sublay одним из 4-х сетчатых протезов. В

каждой группе (n=5) протезы располагали петельными столбиками вдоль средней линии. Через 6 месяцев после операции животных выводили из опыта и макроско-

пически обследовали на предмет осложнений. После этого ПБС иссекали целиком и под стереомикроскопом изучали изменения, возникшие в структуре сеток, оце-

нивали распределение соединительной ткани и выраженность сосудистого ри-

сунка. Методом компьютерной планиметрии определяли размеры имплантатов.

Гистологические срезы из области замещенного сеткой миофасциального дефекта окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону.

В9 серии для пластики грыжевого дефекта у 36 крыс-самцов весом 430 – 480

гиспользовали 3 легкие анизотропные сетки с разной трикотажной структурой и механическими характеристиками при растяжении и изгибе (Parietene light, Dyna light и Ultrapro). Каждую сетку имплантировали 12 животным, но при этом у одной половины животных ее располагали петельными столбиками вдоль средней линии,

70