диссертации / 33

возможность значительного снижения эффективной дозы BMP за счет того,

что биокерамические носители остеоиндуктивны и остеокондуктивны.

Гидроксиапатит. Кость на 70% состоит из гидроксиапатита - формы фосфата кальция. Гидроксиапатит как носитель BMP изучали в виде гранул,

блоков, порошка (Tsuruga E., et al., 1997). Для повышения остеоиндуктивности к гидроксиапатиту с ВМР-2 добавляли коллагеновую губку, коллаген, трикальцийфосфат. Композиции успешно тестировали на экспериментальных моделях in vitro и in vivo (Shimaoka H. et al., 2004).

Отмечено, что для биохимической фиксации на гидроксиапатите BMP может быть в водной фазе или в лиофилизированной форме; технологический процесс не требует повышения температуры, что снижает риск денатурации белка-остеоиндуктора.

Наноразмерные носители BMP. Носители BMP наноразмеров (до 100

нм) успешно исследовались в многочисленных опытах. Микросферы биодег-

радируемого синтетического полимера PLGA способны фиксировать большее количество BMP, вызывая увеличение остеоиндуктивности в экспериментах на кроликах и крысах (Ruhe P.Q. et al., 2005). В опытах на кроликах повышенную остеоиндукцию показывал биокомпозит, состоящий из нанодисперсного коллагена, гидроксиапатита и BMP (WangY.J. et. al., 2003).

Микросферы желатина и декстрана (20-40 мкм) в смеси с термостабилизированнымигидрогелями декстрана и желатина с фиксированными ВМР-2 изучались на предмет активизации перидонтальной регенерации в экспериментах на собаках, длительность выхода ВМР-2

колебалась от 18 до 28 сут, в зависимости от соотношения компонентов биокомпозита (Chen F.M. et al., 2007).

Клиническое применение BMP. Применение rhBMP-7 в виде коллагеновой пасты в терапии больных с открытыми переломами большеберцовой кости способствовало достижению сращения переломов в

большем проценте случаев, сокращало кратность повторных хирургических

61

вмешательств. При этом более высокие дозы BMP были эффективнее

(Friedlaender G.E. et al., 2001; McKee M.D. et al., 2002; Ristiniemi J. et al.,

2007),показано (на небольшом клиническом материале) сокращение сроков заживления переломов по сравнению с таковыми при использовании только аутологичной костной ткани (Bilic R. et al.,2006). ВМР-7 не вызывал аллергических реакций, не замечено гетеротопическогоформирования костивне зоны имплантации (McKee M.D. et al., 2004; Van Houwelingen A., McKee M.D., 2005). Эффект от использования rhBMP-7 для достижения костного сращения при вертебральной патологии сопоставим с эффективностью аутологичной кости (JohnssonR. et al., 2002). Нет проявлений системной токсичности препарата, стеноза позвоночного канала или смещенного формирования кости (VaccaroA.R. et. al., 2003; VaccaroA.R. et. al., 2004). При исследовании, включавшем пациентов в возрасте от 21 года до 24 лет с факторами риска костных несращений (недостаточность надпочечников, гипертония, ожирение, длительное курение, ревматоидный артрит, гипертиреоз), выявлено, что ВМР-7 эффективен и безопасен для достижения спондилодеза (GovenderS. et al. 2002). Vaccaro Vaccaro A.R. et al., 2003; Vaccaro A.R. et al., 2005) обследовали 36 пациентов, оперированныхв связи с дегенеративным поясничным спондилезом со стенозом позвоночного канала. У части больных применялась паста с rhBMP-7 совместно с аутотрансплантатом из гребня подвздошной кости (основная группа), у

других пациентов - аутотрансплантат из гребня подвздошной кости

(контрольная группа). Через 1 год сращение кости определено в экспериментальной группе у 86% пациентов, в контрольной - у 73%, через 4

года - соответственно у 69 и 50%.

Kanayama и соавторы (Kanayama M. et al., 2006) сравнили эффект от применения пасты с rhBMP-7, с керамическими гранулами, и от аутотрансплантатов из гребня подвздошной кости. При этом у 19 больных с дегенеративным спондилолизом на уровне L3-L4 или L4-5 был произведен

заднебоковой спондилодез. У 9 пациентов применяли ВМР-7 (основная

62

группа), у 10 - аутотрансплантат из гребня подвздошной кости (контрольная группа). Сращение кости наблюдалось в основной группе у 78% (7 из 9)

пациентов, в контрольной - у 90% (9 из 10). При морфологическом исследовании полноценное костное сращение показано у 57% (4 из 7)

больных основной и у 78% (7 из 9) пациентов контрольной группы.

Жизнеспособная кость отмечена в 6 из 7 случаев применения ВМР-7 и во всех случаях применения аутотрансплантатов.

Рекомбинантный rhBMP-2 на коллагеновой губке ACS в терапии переломов длинных костей. Govender и соавторы (Govender S. et al., 2002)

описываюттерапию rhBMP-2 на коллагеновом носителе в дозе 0,75 мг/мл

(суммарная доза 6 мг) и 1,50 мг/мл (суммарная доза 12 мг). В исследование включены 450 пациентов из 11 стран с открытыми переломами большеберцовой кости. Всем пациентам производился интрамедуллярный остеосинтез титановым стержнем. RhBMP-2/ACS «Infuse» накладывали на место травмы перед закрытием раны (основная группа). Контролем служила группа пострадавших, лечившихся без применения BMP. Через 12 месяцев обследован 421 (94%) больной. В основной группе сращение переломов замечено в более короткие сроки, чем в контрольной. Положительный результат от применения rhBMP-2 был дозозависимым: при дозе 1,50 мг/мл реже отмечались гнойные осложнения, быстрее происходило заживление,

реже были необходимы повторные оперативные вмешательства, сращение перелома без повторных операций было достигнуто у 74% больных против

54% в контрольной группе. Эти данные способствовали одобрению Европейским агентством по оценке лекарственных продуктов (ЕМЕА) в 2002

г. и Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) в 2004 г. применения rhBMP-2/ACS в терапии открытых переломов большеберцовой кости методом интрамедуллярного остеосинтеза (Govender S. et al, 2002). При использовании rhBMP-2 на коллагеновой губке показана идентичная или большая частота сращения

телпозвонков по сравнению с таковой при применении аутологичного

63

трансплантата из гребня подвздошной кости, сращение получено у 94,5% из

143 больных (Burkus J.K. et al., 2005), у 93,8% из 67 (Haid R.W. et al., 2004), у 99% Из 21 (Mummaneni P.V. et al., 2004), у 100% из 49 пациентов (Schwender J.D. et al., 2005). Осложнения, характерные для хирургического забора аутологичной кости, отсутствовали.

Побочные эффекты при применении BMP редки и проявляются в виде местной эритемы и небольшого отека в области внедрения остеоиндуктора.

Повышена биодеградация аллогенного деминерализованного костного имплантата при добавлении к нему BMP (Fukuroku J. et al., 2007).

При серологическом тестировании больных, в терапии которых использовался rhBMP на биологических носителях, показано наличие антител к рекомбинантному остеоиндуктору, применяемому на коллагеновой губке, однако при этом чаще выявлялись антитела к коллагеновому носителю, чем к самому rhBMP (Roux P. et al., 1999). Противопоказания к применению rhBMP: беременность, онкологическая патология, недоразвитие скелета, гиперчувствительность к BMP и коллагену.

Несмотря на положительные данные, полученные при изучении костных морфогенетических белков, ряд аспектов остается нерешенным:

выбор эффективной технологии получения BMP, адекватного биодеградируемого носителя для BMP, химическая фиксация BMP на биодеградируемом носителе, определение клинически эффективной дозы

BMP в зависимости от этиологии, локализации, выраженности патологического процесса, пути снижения коммерческой стоимости BMP.

Экспериментальные и клинические исследования BMP проводятся практически во всех странах мира. Участие в них большого количества ведущих зарубежных научно-исследовательских центров, подключение значительных финансовых ресурсов позволяют надеяться на дальнейшую эффективную разработку проблемы и успешное применение данного остеоиндуктора в медицине.

64

Исследование влияния наночастиц на организм вносит вклад в развитие фундаментальных представлений о воздействии новых материалов на биологические объекты. Необходимо учитывать повышенную активность наночастиц, в том числе из-за их размера, их использование при более низких концентрациях снижает «нагрузку» и риск вредного влияния на организм.

Наночастицы могут попадать в организм ингаляционно, перорально,

перкутанно и парентерально (конъюгированно с наночастицами). Контакт человека с наноматериалами возможен на стадии разработки, производства,

переработки и использования. Пероральное поступление наночастиц представляет собой еще один путь их попадания в организм. Пероральное поступление возможно в случае контаминации наночастиц пищи, переноса наночастиц в ротовую полость с кожных покровов и, наконец, при пероральном приеме лекарственных препаратов, созданных на основе наночастиц. Хотя всасывание наночастиц в желудочно-кишечном тракте незначительно, в большинстве исследований было показано, что пероральное введение сопровождается некоторым повышением их уровня в плазме крови.

Известно, что степень всасывания наночастиц в желудочно-кишечный тракт зависит от их размера и характеристик поверхности, причем мелкие,

нейтральные гидрофобные наночастицы всасываются лучше, чем крупные и гидрофильные (Hussain et al., 2001). Наночастицы с легкостью проникают в альвеолы легких за счет броуновского движения. Показано, что наночастицы в воздухе имеют тенденцию к спонтанной агрегации и формированию более крупных частиц (Sioutas et al., 2005). В результате конденсации паров воды также может наступать агрегация наночастиц в воздухе. С увеличением размера наночастиц уменьшается вероятность их попадания в альвеолы. При этом агрегация с укрупнением наночастиц в воздухе определяет возможность их контакта с желудочно-кишечным трактом и кожей. Но изобретение искусственных покрытий наночастиц (с помощью полиэтиленгликоля,

например) для снижения их контакта препятствует агрегации воздушных

наночастиц и делает более вероятным попадание их в нижние дыхательные

65

пути. Это было установлено в ходе опытов на грызунах, показана транслокация наночастиц из просвета альвеол в интерстиций легких

(Oberdorster, 2000). Перенос наночастиц из окружающей среды в легкие и впоследствии в кровеносное русло значим, об этом свидетельствуют исследования роли вдыхаемых наночастиц в патоморфозе ряда нозоологий.

Radomski (Radomskiet al., 2005) определили, что углеродные нанотрубкиускоряют тромбообразование in vivo и усиливают агрегацию тромбоцитов in vitro.

Данные о транслокации вдыхаемых наночастиц из альвеолярного дерева в другие органы, неоднозначны. Kreyling (Kreyling WG et al., 2000, Kreyling WG 2002, Kreyling WG, 2004) показали, что у крыс из легких в селезенку, печень, мозг и сердце транслоцируется до 1% иридиевых наночастиц диаметром 80 и 15 нм. В организме человека не установлено прониконовения углеродных меченых технецием –99 наночастиц из легких в другие органы (Brown et al., 2002). Резюмируя, современные данные установлено, что для проникновения наночастиц легкие представляют собой барьер.

В некоторых экспериментальных исследованиях на крысах наблюдалась способность вдыхаемых наночастиц поступать через эпителий носоглотки и обонятельную луковицу в центральную нервную систему (Elder et al., 2006). Результаты этих исследований, по-видимому, не подлежат прямому переносу на аналогичную ситуацию у людей. Это связано с тем, что крысы имеют значительно большую площадь обонятельного эпителия, а

относительная масса их обонятельной луковицы в 177 раз больше, чем у человека. Тем не менее, в некоторых клинических исследованиях был обнаружен захват нейронами обонятельной луковицы человека вводимых интраназально наночастиц золота диаметром 50 нм (de Lorenzo, 1970). Кроме того, хорошо известен факт миграции по нервным путям некоторых наноразмерных вирусов. Таким образом, транслокация вдыхаемых с

воздухом наночастиц в нейроны ЦНС представляется весьма вероятной. Эти

66

данные вызывают особенную настороженность, поскольку в одном из последних исследований было показано, что магниевые наночастицы обладают выраженной нейротоксичностью, вызывая оксидативный стресс,

истощение внутриклеточных запасов дофамина и гибель нейронов (Hussain et al., 2006).

Наночастицы могут поступать в организм человека через кожу.

Усиление интереса к перкутанному пути поступления наночастиц связано с активным использованием нанотехнологий в производстве одежды,

косметических средств и солнцезащитных кремов. Изучению вопроса о проникновении наночастиц оксида титана (10-60 нм), входящих в состав солнцезащитных кремов в качестве поглотителей ультрафиолетового излучения, в эпидермис человека и животных был посвящен целый ряд исследований (Gamer et al., 2006, Mavon et al., 2007). В этих исследованиях не было зафиксировано проникновения наночастиц оксида титана глубже рогового слоя эпидермиса, хотя в некоторых случаях отмечалось их избирательное накопление наночастиц в волосяных фолликулах (Nohynek et al., 2007). С другой стороны, в последнее время были получены данные о хорошей проникающей способности квантовых точек через кожу. В иных экспериментах (Ryman-Rasmussen et al., 2006) изучалось влияние размера,

заряда и формы квантовых точек на глубину их проникновения через кожу свиньи in vitro. При этом мелкие сферические квантовые точки, в отличие от крупных квантовых точек эллиптической формы, проходили через эпидермис и накапливались в дерме. В то же время, прохождения квантовых точек через все слои кожи авторы этой работы не наблюдали. Проникновение наночастиц железа, имеющих диаметр менее 10 нм, в дерму кожи человека in vitro было показано в работе Baroli et al. (2007). Таким образом, имеющиеся данные свидетельствуют о том, что «мелкие» наночастицы могут преодолевать кожный барьер, особенно в условиях повреждения кожи или ее заболеваний.

67

Исследования кожной токсичности наноматериалов не выявили сколько-нибудь значимых негативных эффектов при локальном нанесении на кожу различных рецептур, содержащих наночастицы. С другой стороны,

некоторые наноматериалы обладали достаточно высокой цитотоксичностью,

выявленной на клеточных культурах in vitro (Sayes et al., 2006). Такое противоречие с результатами, полученными in vivo, может объясняться меньшей проникающей способностью наночастиц через интактную кожу.

Эта точка зрения находит дополнительное обоснование в виде результатов экспериментов (Sato et al., 2005), которые показали формирование крупных гранулем при подкожной имплантации нанотрубок крысам.

Токсичность наночастиц может быть связана с двумя основными взаимосвязанными механизмами - воспалением и оксидативным стрессом

(Dick et al., 2003). При этом совершенно очевидно, что далеко не все наночастицы обладают способностью индуцировать воспаление и оксидативный стресс. Так, например, в других изысканиях (Xia et al., 2006)

было обнаружено, что оксид титана, нанодисперсный углерод и карбоксилированый полистирол не вызывают окислительного стресса в линии макрофагов мыши, тогда как катионный полистирол и наночастицы,

загрязняющие воздух, вызывали значимое усиление образования свободных радикалов. Потенциальная токсичность некоторых типов наночастиц может быть связана со специфическими механизмами. В частности, катионные дендримеры могут вызывать дезинтеграцию плазмалеммы за счет взаимодействия положительно заряженных терминальных группировок дендримера и отрицательно заряженных липидов, входящих в состав мембраны (Mecke et al., 2004).

На сегодняшний день освещены данные экспериментов, показывающих токсичность нанотрубок при их ингаляции мелким грызунам. При этом пролонгированная экспозиция однослойных и многослойных нанотрубок может вызывать хроническое воспаление легких, формирование гранулем,

фиброз и в некоторых случаях смерть (Warheit et al., 2004, Саггего-Sanchez et

68

al., 2006). Интратрахеальное введение эквивалентной массы нанотрубок и нанодисперсного углерода позволило определить, что воспалительные изменения в легких являются специфическими именно для нанотрубок,

поскольку введение углеродных наночастиц не сопровождалось какими-либо гистологическими нарушениями в легких (Shvedova et al., 2005).

Характерен тератогенный эффект (Lewinski N., 2008) наночастиц серебра. При размеромах 5-50 нм они цитотоксичны и обладают антибактериальной активностью in vitro по отношению к гепатоцитам крыс

(Alt V., 2004). Генез токсичности повлечен нарушением функционирования митохондрий, окислительным стрессом, повышением проницаемости мембраны (Lesniak W., 2005). По данным ряда авторов, воздействие при экспозиции 28 дней при вдыхании наночастиц серебра на крыс в концентрации 1,73·104 – 1,23·106 частиц/см3 не показало существенной динамики в массе тела и больших отклонений от контрольной группы биохимических показателей анализов крови. (Ji J.H., 2007).

Выраженной токсичностью обладают наночастицы алюминия, они снижают синтез м-РНК, индуцируют клеточную пролиферацию, вызывают проатерогенное воспаление, дисфункцию митохондрий (Chen L., 1998).

Подробно описаны токсические свойства соединенийуглерода. Одностенные и многостенные УНТ цитотоксичны и индуцируют оксидантный стресс

(Donaldson K., 2006).

Установлено, что провоспалительные эффекты наночастиц зависят от площади их поверхности. Так, ингаляция наноразмерных частиц оксида титана в течение 3 месяцев вызывала более выраженные воспалительные изменения в легких, чем ингаляция микрочастиц того же вещества

(Oberdorster et al., 1994). Аналогичная зависимость провоспалительного эффекта от удельной площади поверхности наблюдалась и у углеродных наночастиц в ходе экспериментов на крысах (Donaldson et al., 2002). С другой стороны, некоторые исследования не подтверждают зависимости

выраженности воспалительного ответа от размера и площади поверхности

69

наночастиц (Sayes et al., 2006). Существует мнение, что наличие провоспалительных эффектов наночастиц зависит не от площади их поверхности, а от свойств поверхности как таковой. В другом исследовании

(Warheit et al., 2006) реактивность поверхности кварцевых наночастиц различного размера оценивалась с помощью гемолитического потенциала.

При этом выраженность воспалительных изменений в легких коррелировала не с размером наночастиц, а с реактивностью их поверхности.

Исследования острой системной токсичности наночастиц немногочисленны. Результаты этих исследований свидетельствуют о том, что большинство наноматериалов могжет быть отнесено к разряду умеренно токсичных и малотоксичных по классификации Hodge и Sterner (1949). LD 50

этих веществ колеблется от 50 до 5000 мг/кг. Интересным является тот факт,

что для большинства наночастиц органами-мишенями входят в состав ретикуло-эндотелиальной системы. Так, например, при исследовании острой системной токсичности G3 катионного меламинового дендримера в качестве органа-мишени была идентифицирована печень (Neerman et al., 2004). Эти данные вполне объяснимы, поскольку наночастицы после опсонизации действительно активно захватываются элементами ретикуло-эндотелиальной системы. Поскольку наночастицы, используемые в биомедицинских целях,

зачастую покрывают биосовместимыми покрытиями, затрудняющими их распознавание и поглощение фагоцитами, органы-мишени для таких частиц могут быть иными. В частности, важную роль в элиминации такого рода наночастиц могут играть почки. Такие наночастицы, как углеродные нанотрубки, водорастворимые производные фуллеренов и дендримеры невысоких порядков преимущественно выводятся из организма почками

(Stern, Mc Neil, 2008).

Изысканияна мышахтоксичности наночастиц меди (23,5 нм),

микрочастиц меди (17 микрон) и ионов (CuCl2) при пероральном введении определило параметры острой токсичности (ЛД50): 413, 5000 и 110 мг/кг

(Chen Z., 1998). Печень, селезенка, почки показаны органами-мишенями для

70