диссертации / 25

61

повышается при снижении вязкости мембраны клеток, ее эластичности (Racca A. et al., 1999).

Большую роль в развитии активации макрофагов играет изменение состава,

топографии и метаболизма мембранных фосфолипидов клетки. При окислитель-

ном стрессе усиливаются процессы перекисного окисления липидов, которые вы-

зывают увеличение вязкости клеточных мембран макрофагов за счет изменения жирно-кислотного состава, что также сопровождается повышением активности клеток (Шарманов А. Т. и др., 1986). По другим данным, функции макрофагов окислительный стресс снижает (Raley M. J., Loegring D. J., 1999).

РЕЗЮМЕ

Нарушение маточно-плацентарного кровообращения, несмотря на активное изучение, остается одной из важнейших причин заболеваемости и смертности в перинатальный период. Как показывают данные литературы, выраженная кисло-

родная недостаточность в течение беременности обладает резко отрицательным влиянием на плод, следствием которого является снижение выживаемости и внут-

риутробная задержка роста. Это снижает адаптационные возможности в постна-

тальном периоде, обуславливая гибель и рождение физиологически незрелого потомства с выраженными осложнениями. Известно, что к возникновению данной патологии беременности приводят многочисленные и разнообразные причины. К

ним относятся экстрагенитальные заболевания, гинекологические заболевания наличие вредных привычек у беременных, неблагоприятные социально-бытовые факторы и другие.

Проблема нарушения маточно-плацентарного кровообращения в настоящее время активно изучается. Наиболее адекватным методом моделирования внутри-

утробной гипоксии в эксперименте, как показывают многочисленные экспери-

62

ментальные работы, является лигирование преплацентарных кровеносных сосу-

дов. Данные о механизмах влияния на течение беременности экзогенных донато-

ров NO, в том числе нитроглицерина, и альфа-токоферола, свидетельствуют о том, что оксид азота чаще всего используется в качестве гипотензивного и токо-

литического средства, а витамин Е как ингибитор гиперактивных свободноради-

кальных процессов при различной патологии беременности. В тоже время, многие вопросы требуют дальнейших фундаментальных исследований.

63

Глава 2

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основу работы составили результаты изучения влияния оксида азота и аль-

фа-токоферола на компоненты системы мать - плод и раннее постнатальное раз-

витие эритроцитарной системы потомства крыс.

Исследование проводилось на белых беспородных крысах-самках, содер-

жащихся в условиях вивария, на стандартном рационе питания, имеющих свобод-

ный доступ к воде (Западнюк И. П. и др.,1983).

С целью получения животных с датированным сроком беременности был использован метод вагинальных мазков (Дыбан А. П. и др., 1975). Ежедневно ис-

следовались вагинальные мазки интактных крыс-самок, а затем из стада отбира-

лись те животные, у которых фаза эстрального цикла соответствовала проэструсу или раннему эструсу. Микроскопический анализ вагинальных мазков на наличие сперматозоидов производился каждое утро. Их выявляли в неокрашенных препа-

ратах с помощью светового микроскопа под малым увеличением. Первым днем беременности считался день обнаружения сперматозоидов в вагинальном мазке.

Использование крыс в качестве объекта исследований обусловлено с одной стороны тем, что при экспериментальной фетоплацентарной недостаточности ге-

терохронность отставания в росте и развитии тканей и органов подобна таковой при нарушении маточно-плацентарного кровообращения у плода человека (Гар-

машева Н. Л., Константинова Н. Н., 1985). С другой стороны, у крыс, как и у че-

ловека, тип плаценты гемохориальный, что имеет важное значение для интерпре-

тации данных при использовании этого вида животных в эксперименте (Карлсон Б., 1983).

Экспериментальное нарушение маточно-плацентарного кровообращения моделировалось с помощью методики М. М. Вартановой (1984) перевязкой 1/3

64

части преплацентарного сосудистого пучка на 16-й день беременности, т.е. в тот период, когда уже завершена плацентация и происходит полный переход плода на плацентарное кровообращение. Нарушение кровотока через 1/3 всех приводящих и отводящих сосудов вызывает нарушение маточно-плацентарного кровообраще-

ния, которое вызывает внутриутробную гипоксию и гипотрофию плода (Томило-

ва И. К., 2012).

Для моделирования НМПК животное фиксировалось в положении на спине,

после чего осуществляли вскрытие брюшной полости. В операционную рану вы-

водили оба рога матки с плодами. Непосредственно около плодовместилищ осу-

ществляли лигирование 1/3 преплацентарных сосудов, затем рану послойно заши-

вали. Операция продолжалась около 10 – 15 минут. После операции животное находилось в отдельной клетке, где вело обычный образ жизни.

Для оценки эффектов экзогенного донатора, ингибитора синтеза оксида азота и альфа-токоферола взрослые животные были разделены на 13 групп

(табл. 1):

1)интактные небеременные крысы-самки;

2)животные с физиологической беременностью;

3)небеременные крысы-самки, получавшие вместо питьевой воды 0,2% раствор донатора оксида азота нитрита натрия ежедневно в течение 20 дней (группа срав-

нения) (Roth A. C. et al., 1987);

4)беременные крысы-самки, получавшие вместо питьевой воды 0,2% раствор нитрита натрия с 1-го дня беременности;

5)небеременные крысы-самки, получавшие неселективный ингибитор синтеза оксида азота L-NAME в дозе 10 мг/кг внутримышечно ежедневно (Huang H.-S. et al., 2008) в течение 20 дней (группа сравнения);

6)беременные крысы-самки, получавшие L-NAME внутримышечно в дозе 10

мг/кг с 1-го дня беременности;

65

7) небеременные крысы-самки, получавшие фармакопейный альфа-токоферол внутримышечно в дозе 150 мг/кг 2 раза в неделю в течение 20 дней (группа срав-

нения) (Kilic F. S., Erol K., 2003; Bosland M. C. et al., 2006);

8)беременные крысы-самки, получавшие альфа-токоферол в дозе 150 мг/кг 2 раза в неделю с 1 дня беременности;

9)ложнооперированные беременные крысы (группа сравнения);

10)беременные крысы с экспериментальным НМПК;

11)беременные крысы с НМПК на фоне поступления с питьевой водой 0,2% рас-

твора нитрита натрия с 1-го дня беременности;

12) беременные крысы с НМПК на фоне введения L-NAME внутримышечно в до-

зе 10 мг/кг с 1 дня беременности;

13) беременные крысы с НМПК на фоне введения альфа-токоферола внутримы-

шечно в дозе 150 мг/кг 2 раза в неделю с 1 дня беременности.

Для изучения влияния НМПК, эффектов экзогенного донатора оксида азота и альфа-токоферола на эритроцитарный системогенез потомства белых крыс, взрослые животные были разделены на следующие группы (см. табл.

1):

14) животные с физиологической беременностью; 15) крысы с НМПК на 16 день беременности;

16) животные с физиологической беременностью, получающие экзогенный дона-

тор оксида азота «Депонит-10» с 16 дня беременности до окончания срока геста-

ции. На внутреннюю поверхность ушной раковины им наклеивали пластырь трансдермальную терапевтическую систему (ТТС) «Депонит – 10» (площадью

5мм2). Пластырь содержал нитроглицерин и обеспечивал его выделение со скоро-

стью 0,001мг/кг/ч. Препарат «Депонит – 10» произведен фирмой «Schwarz Pharma» (Германия). ТТС меняли ежедневно до момента родов.

17) животные после НМПК, получающие экзогенный донатор оксида азота «Де-

понит – 10» до окончания срока гестации;

66

18) животные с физиологической беременностью на фоне введения альфа-

токоферола внутримышечно в дозе 150 мг/кг 2 раза в неделю с 16 дня беременно-

сти до окончания срока гестации;

67

19) крысы с НМПК на фоне введения альфа-токоферола внутримышечно в дозе

150 мг/кг 2 раза в неделю с момента операции до окончания срока гестации.

1.Оценка показателей взрослых крыс 1 – 13 групп:

1)показатели красной крови: концентрация эритроцитов, гемоглобина, пока-

затель гематокрита, содержание ретикулоцитов;

2)биохимические показатели сыворотки крови: концентрация суммарных нитратов и нитритов (NOx), концентрация нитротирозина; концентрация кальция; концентрация эндотелиального фактора роста сосудов VEGF-C;

концентрация цитруллина; состояние свободнорадикальных процессов и антиоксидантная активность.

3)исследование фагоцитарной активности перитонеальных и плацентарных макрофагов в краткосрочных культурах у взрослых крыс по следующим критериям:

a.оценка in vitro фагоцитарной активности перитонеальных и плацентарных макрофагов у животных всех групп;

b.оценка in vitro фагоцитарной активности перитонеальных и плацентарных макрофагов у животных 2-й и 10-й групп при введении в среду для инкуба-

ции клеток разных концентраций следующих веществ:

-Nw-nitro-L-arginine methyl ester,

-липополисахарид E. coli,

-водорастворимая форма эстрадиола,

-водорастворимая форма прогестерона,

-водорастворимый аналог токоферола trolox (6-гидрокси-2,5,7,8-диметилхроман- 2-карбоксильная кислота 97%),

-супероксиддисмутаза;

c.оценка in vitro фагоцитарной активности перитонеальных и плацентарных макрофагов у животных 8 и 13 групп при введении в среду для инкубации клеток разных концентраций следующих веществ:

68

-Nw-nitro-L-arginine methyl ester,

-липополисахарид E. coli,

-водорастворимая форма эстрадиола,

-водорастворимая форма прогестерона.

2.Изучение морфологических и метаболических характеристик плаценты у крыс 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13 групп по следующим критериям:

1)масса;

2)патоморфологическое исследование: оценка материнского и плодового кро-

вообращения, состояния трофобласта;

3)биохимическое исследование: концентрация суммарных нитратов и нитри-

тов, нитротирозина; состояние свободнорадикальных процессов и антиок-

сидантная активность.

3.Оценка состояния плодов на 20 день беременности у крыс 2-й, 4-й, 6-й, 8-й, 9-

й, 10-й, 11-й, 12-й, 13-й групп по следующим критериям:

1)масса;

2)состояние эритроцитарной системы: концентрация эритроцитов, гемогло-

бина, содержание оксифильных проэритроцитов, процент эритроидных кле-

ток в кроветворных органах;

3)биохимические показатели сыворотки крови: концентрация суммарных нитратов и нитритов, нитротирозина, кальция, состояние свободноради-

кальных процессов и антиоксидантная активность.

4.Оценка состояния 22-дневных плодов и крысят на 2-й, 15-й и 30-й день жиз-

ни, полученных от животных 14 - 19 групп (табл. 2):

1)масса;

2)показатели эритроцитарной системы: содержание эритроцитов, гемоглоби-

на, показатель гематокрита, концентрация ретикулоцитов, содержание ок-

сифильных проэритроцитов, процент эритроидных клеток в кроветворных органах;

69

3)исследование перитонеальных макрофагов на 15-й и 30-й день жизни: фаго-

цитарная активность в краткосрочных культурах;

4)биохимический показатель сыворотки крови: концентрация суммарных нитратов и нитритов.

Использование в эксперименте плодов перед родами (в возрасте 22 дней) и

крысят на 2-й, 15-й и 30-й день после рождения связано с важностью этого перио-

да онтогенеза для становления эритроцитарной системы. По данным литературы,

в этот период развития изменяется интенсивность, место и тип кроветворения

(Дыгай А. М. и др., 1981; Назаров С. Б., 1996), а также заканчивается процесс постнатального преобразования эритрона у крыс (Карташов А. Г. и др., 1987;

Назаров С. Б., 1995). По данным Махинько В. И., Никитина В. Н. (1975), в иссле-

70

дуемый период физиологические особенности организма крысят соответствуют особенностям у детей от рождения до 4 – 7 лет.

Для исследования гематологических показателей забор крови осуществлял-

ся с использованием антикоагулянта С – гепариноида («Спофа», Чехия).

Эвтаназия животных производилась путем дислокации шейных позвонков

(взрослые животные) и декапитации (крысята).

А) Для оценки СОСТОЯНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОЙ СИСТЕМЫ использова-

лись следующие группы методов.

1) Исследование эритроцитарного состава периферической крови:

-определение концентрации эритроцитов;

-определение концентрации гемоглобина;

-определение показателя гематокрита.

2) Исследование морфо–функциональных характеристик эритроцитов:

- расчет морфометрических индексов эритроцитов (средний объем эритроцита,

среднее содержание гемоглобина в эритроците, средняя концентрация гемоглоби-

на в эритроците).

3) Оценка состояния эритропоэза:

- определение относительной и абсолютной концентрации ретикулоцитов в пери-

ферической крови;

-определение концентрации оксифильных проэритроцитов в периферической крови;

-определение содержания эритроидных клеток в печени, селезенке, красном костном мозге.

Концентрацию эритроцитов в крови определяли стандартным способом в камере Горяева. Для определения концентрации гемоглобина использовали унифицированный гемоглобинцианидный метод с использованием гемоглобино-

метра ГФ-Ц-04. Гематокрит измеряли путем центрифугирования крови в гепари-

низированных капиллярах («Меdata АВ», Sweden) на микроцентрифуге МГЦ-8