диссертации / 25

181

нитротирозина. У плодов дополнительно исследовали эритроцитарный состав пе-

риферической крови как критерий выраженности гипоксии, и концентрацию кальция для оценки его поступления через фетоплацентарный барьер.

В результате проведенного исследования выявлено, что у интактных бере-

менных крыс на 20-й день показатели периферической крови (эритроциты, гемо-

глобин, гематокрит) достоверно снижаются по сравнению с результатами первого дня беременности. Причиной может являться физиологическая гемодилюция, а

также уменьшение продолжительность жизни красных клеток крови по сравне-

нию с небеременными животными. Происходит повышение концентрации эритропоэтина, который индуцирует «чрезвычайный» эритропоэз с образованием макроцитов, имеющих меньшую продолжительность жизни (Lurie S., Danon D.,

1992). Количество ретикулоцитов увеличивается в связи с повышением уровня эритропоэтина и прогестерона, стимулирующих эритропоэз (De Rijk E. P. C. T. et al., 2002). При физиологической беременности на 20-й день концентрации NOx и

цитруллина в крови повышаются по сравнению с небеременными крысами. Оксид азота активно синтезируется из L-аргинина, с образованием цитруллина, в сосу-

дах матки и плаценте за счет интенсивного образование эндотелиальной NO-

синтазы и повышения кальций-зависимой активности NO-синтаз (Nelson S. H. et al., 2000). Он отвечает за ряд изменений, включающих увеличение почечного, ма-

точного, фетоплацентарного кровотока, снижение сосудистого сопротивления и уменьшение прессорного ответа на сосудосуживающие агенты, угнетение сокра-

тительной активности матки и увеличение продолжительности гестации (Sladek S. M. et al., 1997). К концу физиологической беременности происходит снижение ге-

нерации перекиси водорода (уменьшение пролиферативного эффекта, синтеза ин-

тегринов и матриксных металлопротеаз) и дисмутации супероксид анион-

радикала, что увеличивает риск образования пероксинитритов (Шестопалов А. В., 2007). Эти изменения проявляются в повышении концентрация нитротирозина и показателей ХЛ крови, характеризующих активность свободнорадикальных про-

цессов. При физиологической беременности наблюдается уменьшение поступле-

182

ние L-аргинина в эндотелий сосудов матери. NO-синтаза при дефиците этой ами-

нокислоты образует свободнорадикальные соединения (Goodrum L. A. et al.,

2003). Плацента также продуцирует липидные перекиси в большом количестве

(Walsh S. V., Wang Y., 1993), но она является и источником антиоксидантных ферментных систем (Toescu V. et al., 2002). Работы Wisdom S. Y.et al. (1991) и

Walsh S. V. (1993) показывают, что активность важных антиоксидантных фермен-

тов – супероксиддисмутаз и глутатион пероксидазы – снижается в крови бере-

менных. Эти результаты подтверждаются в наших исследованиях – антиокси-

дантный потенциал крови на 20-й день беременности достоверно меньше по срав-

нению с 1-м днем. Таким образом, физиологическое течение беременности сопро-

вождается относительным дисбалансом работы систем регуляции процессов сво-

боднорадикального окисления и антиоксидантной защиты (Флоренсов В. В. и др., 2005), что мы и наблюдаем в нашем случае.

У беременных крыс происходит снижение концентрация кальция в крови по сравнению с 1-й группой, что может быть результатом использования этого кати-

она плодами, а также следствием физиологической гемодилюции и повышенной фильтрации в почках (Ritchie L. D. et al., 1998). При этом уровень Са2+ у плодов достоверно выше, чем, матерей, что связано с более высокой паратиреоидной ак-

тивностью (Anai T. et al., 1999). Кроме того, как уже упоминалось выше, увеличи-

вается образование эндотелиальной NO-синтазы и кальций-зависимый синтез NO

по сравнению с кальций-независимым синтезом, кальций используется на эти процессы (Nelson S. H. et al., 2000).

Уровень VEGF-C в крови достоверно повышается, что связано с активным процессом ангиогенеза в плаценте и у плода на момент исследования.

При физиологической беременности у животных активность перитонеаль-

ных макрофагов повышается по сравнению с интактными небеременными крыса-

ми. Активацию процесса фагоцитоза можно объяснить изменением гормонально-

го фона, работы иммунной системы, напряженным эритропоэзом (Carvalho-Freitas M. I. et al., 2007; Wan H. et al., 2007). Также происходит окислительное поврежде-

183

ние мембран эритроцитов, изменение состава, топографии и метаболизма фосфо-

липидов, повышение вязкости клеточной мембраны самих макрофагов при акти-

вации перекисных процессов, что оказывает стимулирующее действие на клетки

(Шарманов А. Т. и др., 1986). Активность плацентарных макрофагов гораздо меньше, чем перитонеальных, что может быть связано с запуском к концу бере-

менности процессов апоптоза в плаценте на фоне снижения пролиферации.

Поступление донатора оксида азота нитрита натрия с 1-го дня беременности вызывает развитие метгемоглобинемии и гемической гипоксии (Гоженко А. И. и

др., 1996). При этой форме гипоксии кривая диссоциации пигмента крови сдвига-

ется влево, наблюдается повышение сродства гемоглобина к кислороду. Содер-

жание в эритроцитах 2, 3-дифосфоглицерата, стимулирующего отдачу кислорода в тканях, снижается (Середенко М. М. и др., 1987), что усугубляет гипоксию. Эн-

дотелиальная NOS участвует в нитритредуктазном процессе преимущественно при дефиците кислорода. Добавление аргинина или неселективного блокатора фермента препятствует превращению нитритов в NO, что связано с конкуренцией этих веществ с нитритами (Webb A. J. et al., 2008). Нитриты увеличивают синтез АТФ в эритроцитах и его выход из клетки, что вызывает вазодилатацию через ак-

тивацию пуринеэгических рецепторов эндотелия и повышает образование оксида азота (Cao Z. et al., 2009). Кроме того, АТФ является механизмом снижения срод-

ства гемоглобина к кислороду (Моисеева О. И., 1985), что может частично ком-

пенсировать дефицит 2, 3-дифосфоглицерата.

Нарушение нормальной микроциркуляции, к которой приводят изменения мембраны эритроцитов под влиянием нитритов, также обусловливают тяжесть гемической гипоксии (Lipowsky H. H. et al., 1993). У животных этой группы отме-

чается повышение концентрации ретикулоцитов, что является естественным отве-

том на хроническую гипоксию. Оксид азота стимулирует выработку гипоксия-

индуцибельного фактора 1-альфа, который увеличивает образование эритропоэ-

тина (Brune B., Zhou J, 2007). Концентрация эритроцитов и гемоглобина в этих условиях достоверно не меняется вследствие избыточного разрушения красных

184

клеток крови мононуклеарно-фагоцитарной системой (Иванова А. С., 2008). Од-

новременно в крови увеличивается содержание NOx по сравнению с интактными беременными крысами. Повышение уровня нитритов при поступлении их в орга-

низм закономерно, большая концентрация у беременных животных связана, веро-

ятно, со сниженной активностью систем метаболизма. Воздействие нитрита натрия повышает интенсивность свободнорадикальных процессов (Реутов В. П. и

др., 1997; Степуро И. И. и др., 1997), о чем свидетельствуют результаты опреде-

ления концентрации нитротирозина и индуцированной ХЛ крови. Концентрация кальция в крови у этих животных достоверно повышается по сравнению со 2-й

группой. Это может быть связано с неблагоприятным влиянием избытка оксида азота и свободных радикалов на процесс транспорта катиона через фетоплацен-

тарный барьер, нарушением работы почечного фильтра матери, так как наруша-

ются все основные почечные функции (Gozhenko A. I. et al., 2003). Кроме того, в

условиях экзогенного поступления NO снижается кальций-зависимый его синтез.

При введении донатора оксида азота повышается концентрация VEGF-C в

крови. Ведущим механизмом, объясняющим увеличение эндотелиального факто-

ра роста, может быть возникновение гемической гипоксии, как в организме мате-

ри, так и плода. Происходит активация метаболических путей, регулируемых та-

кими белками, как индуцируемый гипоксией фактор 1-альфа, и снижается образо-

вание антиангиогенных веществ (Fujita D. et al., 2010). Второй механизм стимуля-

ции образования VEGF - снижение уровня глюкозы в тканях, что имеет место при дефиците кислорода (Спринджук М. В., 2010). Третьим путем активации является увеличение свободнорадикальных процессов при избытке оксида азота, которые также стимулируют продукцию эндотелиального фактора роста (Wu J. et al., 2011). При связывании VEGF со своим рецептором происходит активация сиг-

нального каскада, приводящего к фосфорилированию фосфорилазы Сγ1 и актива-

ции митоген-активируемой протеин-6-киназы, что вызывает увеличение внутри-

клеточного содержания кальция и инозитол-1,4,5-трифосфата. Повышение кон-

центрации кальция активирует NOS к образованию NO (Мартынов А. И. и др.,

185

2005; Bhandari V. et al., 2008). В результате формируется своеобразный замкнутый круг, который может привести с одной стороны к улучшению оксигенации плода,

а с другой – к нарушению нормальной архитектоники сосудов плаценты и плода,

усугублению гипоксии.

При поступлении нитрита натрия у беременных крыс повышается актив-

ность перитонеальных макрофагов по сравнению с интактными беременными крысами, что связано с влиянием NO и нитритов на макрофаги и фагоцитируемые объекты. Оксид азота вызывает активацию первой стадии фагоцитоза, стимулиру-

ет адгезионную активность макрофагов (Ke X. et al., 2001), оказывает влияние на процесс переваривания фагоцитированных объектов, обеспечивая процесс моди-

фикации лизосомальных мембран, повышая их проницаемость и способствуя вы-

ходу ферментов лизосом (Покровский А. А., Тутельян В. А., 1976). Большую роль в развитии активации макрофагов играет изменение состава, топографии и мета-

болизма мембранных фосфолипидов клетки. Окислительный стресс вызывает усиление процессов свободнорадикального окисления липидов, что приводит вследствие изменения жирно-кислотного состава к повышению вязкости клеточ-

ных мембран макрофагов, также сопровождающейся активацией фагоцитов

(Шарманов А. Т. и др., 1986). При нитрит-индуцированном окислительном стрес-

се в большом количестве образуется малоновый диальдегид, который также сти-

мулирует макрофаги (Hebbel R. P., Miller W. J., 1988). Причинами активации фа-

гоцитоза, на которые оказывают влияние нитриты, являются снижение индекса деформируемости эритроцитов, эластичности, вязкости мембраны (Racca A. et al., 1999). При гемической гипоксии наблюдается снижение pH крови, которое также стимулирует фагоциты (Biondi C. et al., 2002).

Активность плацентарных макрофагов достоверно не меняется, вероятно, в

результате прямого цитотоксического действия избытка NO и других свободно-

радикальных продуктов на эти клетки. Такую особенность можно рассматривать как механизм, предотвращающий активацию iNOS и еще большее повышение ок-

сида азота в организме.

186

В тканях плаценты у крыс с нитритной интоксикацией содержание NOx и

нитротирозина достоверно не меняется по сравнению с интактными беременным крысами, что можно объяснить снижением его эндогенного синтеза. Масса пла-

цент достоверно не отличается от контрольных значений. В лабиринтном отделе плаценты при морфологическом исследовании субхориально обнаружены очаго-

вые кровоизлияния, полнокровие материнских лакун во всех отделах и анемиза-

ция плодовых капилляров. Зоны с нарушенным кровоснабжением отличаются пролиферацией клеток трофобласта и стромы, сочетающейся с некротическими изменениями в ядрах и цитоплазмы первого слоя трофобласта. Гликогеновые клетки, контролирующие углеводный обмен, в состоянии некроза. Зоны резорб-

ции некротического детрита замещены соединительной тканью на разных этапах созревания. Структурные изменения со стороны материнских сосудов, по нашему мнению, являются компенсаторными в ответ на гипоксию. Однако, замедление материнского кровотока закономерно приводит развитию стазов, поэтому ком-

пенсаторный эффект является малоэффективным. Дополнительным фактором,

замедляющим материнское кровообращение, может быть системный вазодилати-

рующий эффект донаторов NO (Miller M. R., Megson I. L., 2007). Активация про-

цессов клеточной и соединительнотканной пролиферации приводит к нарушению цитоархитектоники плаценты. Последний фактор, наряду с некротическими изме-

нения трофобласта, существенно замедляет обменные процессы между двумя кровотоками – материнским и плодовым. Повреждение трофобластических кле-

ток первого слоя, выполняющих функцию эндотелия, приводит к гиперкоагуля-

ции материнской крови. Согласно данным литературы, при гемической гипоксии увеличивается экспрессия фактора Виллебранда, являющегося маркером эндоте-

лиальной дисфункции (Trampont P. et al., 2004). Материнские сосуды в базальном отделе плацент стенозированы за счет периваскулярного склероза. Структурные изменения в базальном отделе связанны не только с гипоксией, существенно отя-

гощающей состояние плодов и приводящей к возникновению порочного круга, но и, вероятно, с формирующейся плацентарной гипертензией, о чем свидетельству-

187

ет сужение просвета сосудов базального отдела плаценты за счет периваскулярно-

го склероза, а также замедление материнского кровотока, сопровождающееся ста-

зами.

Повышенный уровень эндотелиального фактора роста в крови у беремен-

ных крыс не усиливает ангиогенез в плаценте, что может быть связано со сверх-

синтезом растворимого VEGF-рецептора на фоне пониженной оксигенации, что блокирует действие изучаемого фактора (Padavala S. et al., 2006).

У плодов отмечается снижение массы тела вследствие длительного окисли-

тельного стресса (по результатам ХЛ в крови увеличивается количество свобод-

ных радикалов) на фоне дефицита кислорода. Содержание эритроцитов, гемогло-

бина и оксифильных проэритроцитов возрастает в ответ на гемическую гипоксию,

а также существенные нарушения кровообращения в плаценте. В сыворотке зна-

чительно повышается концентрация NOx. В норме у плодов по сравнению с мате-

ринским организмом повышена нитрит-редуктазная активность дезоксигемогло-

бина. При хронической гипоксии эта разница увеличивается, что проявляется в повышении уровня нитритов. Подобные изменения имеют компенсаторное значе-

ние, так как образующийся в результате реакции оксид азота обеспечивает адап-

тацию фетоплацентарной системы (Blood A. B. et al., 2009). Концентрация каль-

ция в крови у плодов увеличивается, что можно объяснить нарушением его ис-

пользования тканями вследствие изменения транспорта катионов через клеточные мембраны в ответ на хронический дефицит кислорода (Балина Ю. Д. и др., 1988).

Одновременно при гипоксии изменяются молекулярные механизмы регуляции кальциевого гомеостаза (Huang S.-T. J. et al., 2004), а также нарушается работа ги-

поталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы плода (Федорова М. В., 1982).

Введение L-NAME в течение 20-ти дней беременности не меняет показате-

ли периферической крови матери, но вызывает снижение суммарных нитратов и нитритов в сыворотке. Это вещество приводит к снижению уровня NO, что связа-

но с конкурентным ингибированием NOS (Гуреев В. В., 2012). Количество сво-

бодных радикалов в крови возрастает вследствие уменьшения антиоксидантного

188

влияния оксида азота (Wink D. et al., 1993). Кроме того, вещества, препятствую-

щие синтезу оксида азота посредством конкурентного ингибирования NO-

синтазы, способствуют разрыву ферментативной активности этого фермента и преобразовывают NO-синтазу в генератор супероксида. Такая разрывающая ак-

тивность в дальнейшем способствует дисфункции сосудов и может играть значи-

мую роль в патогенезе патологии беременности, выступая в качестве источника окислительного стресса сосудов (Boger R. H., 2009). В то же время антиоксидант-

ная активность крови уменьшается. Истощение резервов антиоксидантной систе-

мы может неблагоприятно сказаться при рождении ребенка (Флоренсов В. В. и

др., 2005). Уровень кальция в сыворотке выше нормы. Это, вероятно, связано с блокадой кальций-зависимого синтеза NO и образования эндотелиальной NO-

синтазы (Nelson S. H. et al., 2000). Увеличение концентрации кальция также мож-

но объяснить снижением его поступления к плоду вследствие нарушения фето-

плацентарного кровотока, который прямо пропорционален уровню оксида азота

(Sladek S. M. et al., 1997). В присутствии антагониста NO увеличивается чувстви-

тельность миоцитов сосудов к вазоконстрикторному действию кальция, эндоте-

лина и тромбоксана, и снижается чувствительность к гуморальным вазодилатато-

рам (Liu S. et al., 1994; Villa L. M. et al., 1994). У беременных крыс дефицит NO

снижает показатели почечной фильтрации и ренального кровотока (Abram S. R. et al., 2001), вызывая задержку кальция в организме.

Метилированные аналоги L-аргинина являются важными факторами, спо-

собными оказывать негативное влияние на ангиогенез при беременности (Fliser D., 2005; Savvidou M. D. et al., 2003). Эти соединения снижают экспрессию и ак-

тивность VEGF через блокаду кальций-зависимого синтеза NO (Smith C. L. et al.,

2003). В нашем эксперименте ожидаемого снижения уровня ростового фактора эндотелия не наблюдается. Это можно объяснить стимуляцией синтеза VEGF ар-

териальной гипертензией, возникающей на фоне введения L-NAME при беремен-

ности (Li J. et al., 1997).

189

Неселективный антагонист NO-синтаз значительно активирует перитоне-

альные и плацентарные макрофаги. Усиление фагоцитоза под влиянием L-NAME

можно объяснить с одной стороны нарушением цитоархитектоники мембран эритроцитов (Vokurkova M. et al., 2003), а с другой - свободнорадикальным по-

вреждением мембран красных клеток крови под влиянием чрезвычайно интен-

сивного ПОЛ. В этих условиях через увеличение образования в них интерлейки-

на-6, monocyte chemoattractant protein-1 и ядерного фактора - kB также повышает-

ся активность макрофагов, так как длительное введение L-NAME стимулирует работу воспалительных генов в организме (Gonzalez W. et al., 2000). Согласно со-

временным представлениям, «умеренным воспалением» можно назвать физиоло-

гическую беременность, а «избыточным воспалением» является беременность при гестозе. С точки зрения некоторых авторов, воспаление связано с чрезмерной ак-

тивацией макрофагов (Redman C. W. G., Sargent I. L., 2003) и повышенной про-

дукцией провоспалительных цитокинов на фоне дефицита NO, что мы можем наблюдать в том числе в плаценте в нашем случае.

При введении L-NAME масса плацент увеличивается. Вероятно, дефицит оксида азота нарушает физиологический процесс роста, инвазии и васкулогенеза плаценты (Crocker I. P. et al., 2003; Nath A. K. et al., 2004). С другой стороны, про-

исходящие перестройки можно расценить как компенсаторные, обеспечивающие улучшение гемодинамики (Хоменко Ю. Б., 2006). Увеличение массы противоре-

чит данным литературы (Ma C. et al., 1999), но подобное отличие может быть следствием длительного воздействия ингибитора NO в нашем эксперименте. Тор-

можение синтеза оксида азота в плаценте достоверно снижает концентрацию NOx

в ее тканях. Одновременно в этом органе активируются свободнорадикальные процессы. При патоморфологическом исследовании в лабиринтном отделе пла-

цент кровенаполнения материнских лакун возрастает по направлению к базаль-

ному отделу с образованием резко дилатированных сосудов. Параллельно увели-

чивается кровенаполнение и расширение плодовых капилляров, в которых, осо-

бенно расположенных в центральных и суббазальных отделах, эритроциты

190

сладжированы или гемолизированы. По мере прогрессирования дилатации клетки первого слоя трофобласта уплощаются и становятся безъядерными за счет сме-

щения ядра или его рексиса. Вокруг единичных гликогеновых клеток расположе-

но большое количество эритроцитов, компоненты стромы и клеточные пролифе-

раты. В базальном отделе плацент материнские сосуды преимущественно расши-

рены. Чрезмерная дилатация сосудов сопровождается разрушением расположен-

ных между сосудами перегородок. Морфологические изменения в плацентах ис-

следуемой группы частично повторяют таковые при воздействии нитрита натрия.

Однако, этой группе существенно изменено как кровенаполнение материнских лакун, так и плодовых капилляров. Значительное расширение материнских сосу-

дов, с деструкцией межсосудистых перегородок можно объяснить избытком в ткани плацент свободнорадикальных соединений, относящихся к стимуляторам индуцированной кровотоком дилатации (Микашинович З. И., Олемпиева Е. В.,

2008).

У плодов этой группы масса тела уменьшается. L-NAME приводит к дли-

тельному окислительному стрессу (по данным ХЛ в крови плодов возрастает ко-

личество свободных радикалов), изменяет транспорт аминокислот, в том числе L-

аргинина, через фетоплацентарный барьер плоду (Greenberg S. S. et al., 1997),

снижается влияние NO на рост мышечной ткани (Wu G. et al., 2006). В перифери-

ческой крови достоверно повышено содержание оксифильных проэритроцитов,

свидетельствующее о достаточно выраженной внутриутробной гипоксии. Кон-

центрация эритроцитов и гемоглобина достоверно не меняется. В условиях дефи-

цита оксида азота нарушается регуляция круговорота железа, полученного мак-

рофагами при эритрофагоцитозе (Mulero V. et al., 2002), которое может приводить к изменению процесса образования эритроцитов. Кроме того, при длительном де-

фиците NО меняется структура мембран красных клеток крови, способствующая их активному разрушению (Vokurkova M. et al., 2003). В сыворотке крови у пло-

дов закономерно снижена концентрация NOx и нитротирозина.