диссертации / 25
.pdf171
РЕЗЮМЕ
Исследование массы тела 22-х дневных плодов белых крыс показывает, что достоверные отличия отсутствуют. Уже на 2-й день постнатального развития крысята после НМПК имеют массу, достоверно превышающую данный показа-
тель в группе контроля. Сочетание патологии беременности и введения альфа-
токоферола уменьшает массу крысят по сравнению с изолированным НМПК.
Масса крысят 16-й и 18-й экспериментальных групп превышает массу крысят группы контроля. На 15-й день жизни наблюдается резкое снижение массы тела у крысят, которые развивались в условиях НМПК. Использование «Депонит-10» на фоне НМПК предотвращает это уменьшение. Сочетание альфа-токоферола и НМПК оказывает аналогичное влияние на массу тела. У животных, получавших внутриутробно оксид азота, масса достоверно не меняется, а альфа-токоферол – повышается. На 30-й день развития животных отличия по массе между контролем и НМПК исчезают. Однако у крысят, матери которых получали «Депонит-10» на фоне патологии беременности, происходит значительное увеличение массы тела по сравнению этим же показателем в 14-й и 15-й группе. В тоже время, масса тела крысят, которые внутриутробно подвергались воздействию «Депонит-10», пре-
вышает массу тела крысят группы контроля.
Концентрация эритроцитов плодов крыс, развитие которых происходило в условиях экспериментальной патологии беременности, не отличается от их коли-
чества в крови плодов 14-й группы. Однако, у плодов, получавших экзогенный оксид азота на фоне НМПК, достоверно повышается концентрация эритроцитов по сравнению с этим же показателем у интактных плодов и плодов с НМПК.
Альфа-токоферол, вводимый в этих же условиях, не влияет на описываемый пока-
затель. Применение нитроглицерина и альфа-токоферола у плодов в 16-й и 18-й
группе по сравнению с их количеством у плодов контрольной группы, вызывает достоверное увеличение содержания эритроцитов. Однако, на 2-й день жизни в группе крысят, развивавшихся в условиях внутриутробной гипоксии, отмечается
172
выраженный эритроцитоз. В этой экспериментальной группе содержание красных клеток крови достоверно превышает количество эритроцитов при сравнении с крысятами, у которых осуществлялось введение NO на фоне патологии беремен-
ности. Поступление альфа-токоферола при НМПК, наоборот, вызывает достовер-
ное снижение уровня эритроцитов по сравнению с изолированным НМПК, но эта величина не отличается от уровня контроля. Введение «Депонит-10» и витамина Е на концентрацию красных клеток у интактных крысят не влияет. Количество эритроцитов на 15-й день постнатального периода развития крысят у животных всех экспериментальных групп существенно не отличается. К 30-му дню жизни у крысят, которые развивались в условиях нарушения маточно-плацентарного кро-
вообращения, концентрация эритроцитов значительно снижается. Патология бе-
ременности на фоне поступления нитроглицерина приводит к увеличению их ко-
личества и не отличается от контроля. Введение альфа-токоферола на фоне НМПК достоверно не меняет содержание эритроцитов по сравнению с 15-й груп-
пой, их концентрация существенно меньше, чем у крысят группы контроля.
При исследовании концентрации гемоглобина выявлено, что его содержа-
ние в группе плодов, которые развивались в условиях внутриутробного дефицита кислорода, достоверно не отличается от уровня 14-й группы. У плодов, подвер-
гавшихся воздействию экзогенного NO на фоне НМПК, концентрация гемоглоби-
на достоверно превышает уровень в контрольной группе. Мы так же отметили,
что у интактных плодов использование донатора оксида азота вызывает увеличе-
ние его концентрации, которая превышает данный показатель у контрольной группы. Введение альфа-токоферола не приводит к существенным изменениям исследуемого показателя. У 2-й дневных крысят содержание гемоглобина в крови не имеет достоверных различий между группами животных. К 15-му дню наблю-
дались достоверные различия в концентрации гемоглобина между уровнем у кры-
сят 16-й группы, которые испытали на себе влияние оксида азота, и этим же пока-
зателем в крови крысят 14-й группы контроля. Поступление токоферола не вызы-
вает отличий от контрольных значений. Значительное снижение содержания ге-
173
моглобина отмечается к 30-му дню крысят со ЗВУР. У крысят этой возрастной группы использование ТТС нитроглицерина на фоне НМПК приводит к увеличе-
нию концентрации гемоглобина по сравнению с этим показателем у животных,
внутриутробно испытавших дефицит кислорода. Введение альфа-токоферола на фоне НМПК приводит к сходным изменениям.
У плодов, которые развивались в условиях внутриутробной гипоксии, пока-
затель гематокрита достоверно не отличается от контрольных значений. Экзоген-
ный оксид азота, поступающий на фоне НМПК, способствует повышению этого показателя по сравнению с контрольной группой. У плодов 16-й группы влияние
«Депонит-10» приводит к увеличению показателя гематокрита по сравнению с этим же показателем у плодов группы контроля. Альфа-токоферол на гематокрит существенного влияния не оказывает. Показатели гематокрита у крысят на 2-й и
15-й день жизни сходны у животных всех экспериментальных групп, достоверные отличия отсутствуют. К 30-му дню постнатального развития крысят достоверное снижение показателя гематокрита мы наблюдается у животных с ЗВУР по срав-
нению с контрольной группой. В тоже время нами отмечено, что возрастанию по-
казателя гематокрита способствует использование экзогенного донатора оксида азота у крысят, чье развитие происходило при нарушении маточно-плацентарного кровообращения, по сравнению с его значением у крысят 15-й группы. Возраста-
ние гематокрита отмечается и под влиянием экзогенного NO у 16-й крысят груп-
пы. При поступлении альфа-токоферола на фоне НМПК гематокрит уменьшается по сравнению с контролем, как и у животных с изолированным НМПК.
У 22-х дневных плодов НМПК приводит к выраженному ретикулоцитозу.
Поступление NO и альфа-токоферола на фоне патологии беременности не приво-
дит к достоверным отличиям по сравнению с интактными плодами и плодами с НМПК. У животных, развивавшихся в условиях НМПК, ко второму дню жизни концентрация ретикулоцитов также повышена. Под влиянием экзогенного оксида азота у крысят 17-й группы отмечается ретикулоцитоз, его выраженность больше.
Содержание ретикулоцитов в крови крысят 16-й группы также достоверно пре-
174
восходит их концентрацию у группы контроля. Введение альфа-токоферола в 18-й
и 19-й группах не вызывает достоверных изменений по сравнению с 14-й и 15-й
группой. Выраженный ретикулоцитоз у крысят с ЗВУР по сравнению с животны-
ми контрольной группы наблюдается к 15-му дню жизни. Использование «Депо-
нит-10» у животных, которые развивались в условиях внутриутробной гипоксии,
вызывает снижение концентрации ретикулоцитов по сравнению с этим показате-
лем у крысят 15-й группы. Кроме того, в крови крысят 17-й группы концентрация ретикулоцитов достоверно меньше, чем их содержание у крысят группы кон-
троля. У животных после воздействия альфа-токоферола на фоне НМПК концен-
трация ретикулоцитов ниже, чем у 15-й группы, и она не отличается от значений
14-й группы. В тоже время, у интактных крысят применение нитроглицерина также вызывает достоверное снижение уровня ретикулоцитов. Использование альфа-токоферола приводит к возникновению ретикулоцитоза у крысят 18-й
группы. На 30-е сутки концентрации ретикулоцитов у крысят из групп контроля и НМПК достоверно не отличаются друг от друга. Поступление оксида азота и аль-
фа-токоферола на фоне НМПК также на описываемый показатель влияния не ока-
зывают. Донатор оксида азота у интактных крысят вызывает понижение концен-
трации ретикулоцитов в крови.
Значительное увеличение концентрации оксифильных проэритроцитов от-
мечено у плодов при НМПК. У плодов с ЗВУР, развивавшихся под влиянием нит-
роглицерина «Депонит-10», концентрации оксифильных проэритроцитов в крови достоверно ниже по сравнению с их уровнем у плодов, развитие которых проис-
ходило в условиях НМПК. Альфа-токоферол не вызывает достоверных изменений этого показателя. У новорожденных крысят достоверные отличия концентрации оксифильных проэритроцитов отсутствуют. Уровень оксифильных проэритроци-
тов в крови на 15-й день жизни у крысят, которые развивались в условиях ано-
мальной беременности, увеличивается по сравнению с этим показателем у живот-
ных группы контроля и выше их концентрации у животных после НМПК, кото-
рые внутриутробно получали экзогенный оксида азота. Поступление альфа-
175
токоферола на фоне НМПК достоверно концентрацию этих клеток не снижает, но от уровня контроля также не отличается. На 30-й день жизни концентрация окси-
фильных проэритроцитов во всех группах находится на уровне контрольных зна-
чений.
При исследовании процессов кроветворения в красном костном мозге у плодов с ЗВУР обнаружено, что его интенсивность по сравнению с плодами кон-
трольной группе выше. Кроме того, у плодов наблюдается еще большее увеличе-
ние содержания клеток эритроидного ряда в красном костном мозге после НМПК под влиянием нитроглицерина «Депонит-10» по сравнению с их концентрацией у плодов контрольной группы. У плодов 18-й группы процент клеток эритроидного ряда также повышен по сравнению с интактными плодами, но не отличается от
15-й группы. Интенсивность медуллярного кроветворения у крысят, развивав-
шихся в условиях патологической беременности, на 2-й день жизни сохраняется на высоком уровне, и их число достоверно превышает количество эритроидных клеток у новорожденных крысят группы контроля. Также нами обнаружено, что уменьшает интенсивность процесса кроветворения у крысят после НМПК приме-
нение экзогенного донатора оксида азота. У крысят, чьи матери получали альфа-
токоферол на фоне НМПК, содержание эритроидных клеток достоверно меньше,
чем в 15-й группе, но уровня интактных крысят этот показатель не достигает.
Определенными изменениями в характере процесса медуллярного кроветворения сопровождается 15-й день жизни крысят. Интенсивность процесса кроветворения снижается у крысят, которые развивались при нарушении маточно-плацентарного кровообращения. У крысят контрольной группы содержание эритроидных клеток в красном костном мозге значительно выше их количества у животных со ЗВУР.
У потомства крыс 17-й группы количество эритроидных клеток не отличается от
14-й и 15-й группы. Поступление альфа-токоферола во время патологической бе-
ременности не предотвращает снижение описываемого показателя по сравнению с 14-й группой. В тоже время, под влиянием оксида азота достоверно увеличива-
ется число клеток эритроидного ряда в красном костном мозге крысят 16-й груп-
176
пы. Содержание эритроидных клеток в красном костном мозге к 30-му дню пост-
натального периода развития крысят имеет сходные значения во всех экспери-
ментальных группах.
При изучении кроветворения в печени плодов выявлено, что интенсивность эритропоэз возрастает в печени плодов после НМПК. Значения исследуемого по-
казателя у других групп не отличаются от интактных плодов. В печени крысят после НМПК на 2-й день жизни содержание эритроидных клеток по сравнению с их количеством у животных контрольной группы, как и у плодов, сохраняется также на более высоком уровне. В тоже время, у крысят 16-й группы нами отме-
чено усиление образования эритроцитов в печени под воздействием донатора NO.
У крысят 18-й и 19-й групп показатели не отличаются от контроля. Интенсив-
ность эритропоэза в печени крысят, развивавшихся в условиях НМПК, на 15-й
день жизни снижается и становится по сравнению с животными контрольной группы достоверно ниже. К тому же, как показывают результаты наших исследо-
ваний, у крысят с ЗВУР использование экзогенного оксида азота вызывает сниже-
ние в печени концентрации эритроидных клеток, этот показатель значительно меньше, чем их содержание в печени животных группы контроля. Печеночное кроветворение на 30-й день постнатального развития крысят практически отсут-
ствует, не достоверны межгрупповые различия в его интенсивности.
У потомства белых крыс изучение процесса кроветворения в селезенке не выявляет достоверных межгрупповых различий.
Активность клеточных механизмов эритродиереза у крысят после НМПК на
15-й день жизни значительно повышается. Использование «Депонита-10» и аль-
фа-токоферола у 17-й и 19-й группы снижает активность перитонеальных макро-
фагов по сравнению с 15-й группой, но уровня контроля не достигает. Адгезион-
ная активность у 16-й группы не отличается от контроля. Эритрофагоцитоз у кры-
сят 18-й группы повышен. К 30-му дню жизни активность перитонеальных мак-
рофагов у крысят после НМПК значительно снижается и становится даже мень-
ше, чем у контрольных животных. Использование «Депонита-10» на фоне НМПК
177
эритрофагоцитоз стимулирует по сравнению с изолированным НМПК, но не от-
личается от контроля. При введении беременным крысам альфа-токоферола на фоне НМПК отмечается небольшое повышение фагоцитарной активности по сравнению с 15-й группой.
Исследование содержания суммарных нитратов и нитритов, как конечных продуктов метаболизма оксида азота показывает, что их концентрация в крови 22-
дневных плодов всех групп имеет сходные значения и достоверных различий не имеет. Ко 2-му дню жизни в группе крысят с ЗВУР наблюдается гиперпродукция оксида азота. Под влиянием экзогенного оксида азота у крысят с ЗВУР отмечается увеличение уровня NOх в крови, что значительно превышает их содержание в контроле и не отличается от НМПК. У крысят 19-й группы также повышена кон-
центрация суммарных нитратов и нитритов. Она достоверно отличается от кон-
троля, но не от НМПК. Также повышение уровня NOx отмечается у интактных крысят, чьи матери получали альфа-токоферол, но эта величина гораздо меньше
15-й и 19-й групп. На 15-й день развития крысят 14-й, 15-й, 16-й, 17-й, 18-й групп концентрации суммарных нитратов и нитритов достоверно не отличаются, но у животных 19-й группы наблюдается значительное снижение описываемого пока-
зателя по сравнению, как с контролем, так и с НМПК. К 30-му дню концентрация
NOx в крови животных с ЗВУР продолжает падать, и становится ниже уровня в группе контроля. Экзогенный NO и альфа-токоферол способствуют повышению концентрации суммарных нитратов и нитритов в крови крысят, развивавшихся в условиях НМПК по сравнению с их содержанием в крови животных с НМПК.
178
Глава 7 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Среди множества функциональных систем выделяется особая – мать - плод
(Гармашева Н. Л., Константинова Н. Н., 1978; Савченков Ю. И., Лобынцев К. С., 1980; Колесников С. И., Морозова Л. М.,1985; Назаров С. Б., 1995), которая пред-
ставляет собой совокупность двух самостоятельных организмов, объединенных общей целью – обеспечить нормальное развитие плода и рождение жизнеспособ-
ного здорового потомства. Важнейшим провизорным органом, осуществляющим анатомо-функциональную связь с материнским организмом и создающим опти-
мальные условия для процессов формирования, роста и развития плода, является плацента. Роль ее чрезвычайно велика как при физиологически протекающей бе-
ременности, так и при некоторых осложнениях. Одним из важнейших механизмов патогенеза недостаточности фетоплацентарного комплекса является нарушение маточно-плацентарного кровообращения (Закурина А. Н. и др., 2010; Протопопо-
ва Н. В. и др., 2012; Стрижаков А. П. и др., 2003; Сидорова И. С., Макаров И. О., 2000), приводящее к внутриутробной гипоксии. В организме плода в ответ на из-
менившиеся условия существования происходят компенсаторно-
приспособительные изменения практически во всех физиологических системах,
которые направлены на адаптацию к неблагоприятным условиям развития (Лу-
канская Е. Н., 2013; Полячикова О. Л., Бородули Г. М., 2009; Nusken K.-D. et al., 2008), возникает «задержка внутриутробного развития», что оказывает негатив-
ное влияние на рост и развитие в постнатальном онтогенезе (Fu W. et al., 2005; Jobgen W. S. et al., 2006; Wu G., 2006). В то же время, при длительном и прогрес-
сирующим действии дефицита кислорода на организм плода становится неэффек-
тивной реализация компенсаторно-приспособительных реакций, что может при-
водить к внутриутробной гибели.
В настоящее время механизмы НМПК, его влияние на функциональную си-
стему мать - плод, а также дальнейшее развитие потомства интенсивно изучается
179
не только в клинике, но и в условиях лаборатории. Наиболее часто используемым и адекватным способом моделирования НМПК является перевязка преплацентар-
ных сосудов (Вартанова М. М., 1984; Кучерявенко А. Н., Карымшакова К. К.,
1985; Клименко Т. А. и др., 1982; Лысая Т. Н. и др., 1990; Lane R. H. et al., 1996; 1998; Ozanne S. E., 2001; Pan S. L., Yu Y. H., 2002; Simmons R. A. et al, 2001).
Важным фактором патогенеза фетоплацентарной недостаточности является изменение продукции оксида азота (Новиков А. А., 2005; Шестопалов А. В., 2007;
Wu G. et al., 2006). Поэтому, при лечении хронической фетоплацентарной недо-
статочности в последние годы все чаще используются препараты L-аргинина (ис-
точника синтеза NO) и донаторы оксида азота (Акуева М. Б., 2009; Буштырева И.
О. и др., 2006; Малаховская Е. А., Зайнулина М. С., 2004; Шестопалов А. В.,
2007).
При повышении концентрации NO, а также в условиях хронической гипо-
ксии активируются свободнорадикальные процессы, образуется высокотоксичное соединение пероксинитрит, который вызывает повреждение клеток и тканей
(Джериева И. С., Волкова Н. И., 2011; Линде В. А. и др., 2011; Стародубцева М.
Н., 2011). Поэтому, для коррекции плацентарной недостаточности в клинике ис-
пользуют антиоксиданты (Franco Mdo C. et al., 2003; Tan D. X. et al., 1998).
Для установления значения NO и свободнорадикальных процессов при фи-
зиологической беременности и нарушении функционирования системы мать -
плод при НМПК, на первом этапе работы интактные небеременные и беременные крысы, а также животные с НМПК получали донатор оксида азота (нитрит натрия), ингибитор его образования (метиловый эфир L-аргинина) и альфа-
токоферол. У них оценивали ряд показателей: эритроцитарный состав перифери-
ческой крови, метаболизм NO, состояние свободнорадикальных процессов, уро-
вень кальция, концентрацию эндотелиального фактора роста и активность макро-
фагов.
Изучение эритроцитарного состава периферической крови проводилось с целью оценить изменение этого компонента кислородтранспортной системы под
180
влиянием NO, альфа-токоферола до и после оперативного вмешательства при мо-
делировании НМПК. Исходя из данных литературы (Bruning-Fann C. S., Kaneene J. B., 1993; Grant D., Butler W. H., 1989; National Toxicology Program, 2001) и соб-
ственных исследований автора (Иванова А. С., 2008), изменения должны быть существенными. Метаболизм NO оценивали по содержанию конечных метаболи-
тов оксида азота – суммарных нитратов и нитритов (Miranda K. M. et al., 2001);
концентрации нитротирозина – маркера повреждения аминокислот пероксинит-
ритом (Стародубцева М. Н., 2011); уровню цитруллина – продукта, образующего-
ся при синтезе NO из L-аргинина (Реутов В. П. и др., 1997). Кальций участвует в работе конститутивной NO-синтазы (Nelson S. H. et al., 2000), также по его кон-
центрации у матери можно косвенно судить о состоянии транспортных механиз-
мов плаценты. Согласно данным литературы, изменение продукции оксида азота,
и плацентарная недостаточность влияют на процессы ангиогенеза, что послужило поводом к определению эндотелиального фактора роста VEGF-С (Крукиер И. И.,
Погорелова Т. Н., 2006; Fliser D., 2005; Savvidou M. D. et al., 2003). Для изучения состояния свободнорадикальных процессов и антиоксидантной активности про-
водилось измерение показателей биохемилюминесценции и определение концен-
трации нитротирозина. Также у взрослых животных проводилась оценка активно-
сти перитонеальных и (по возможности) плацентарных макрофагов. У интактных небеременных и беременных крыс, а также животных с НМПК, дополнительно исследовалось влияние ряда биологически активных веществ (водорастворимый аналог токоферола, супероксиддисмутаза, эндотоксин E. coli, метиловый эфир L-
аргинина, эстрадиол, прогестерон) на функциональную активность макрофагов.
Следующим шагом исследования функциональной системы стало изучение состояния плацент и плодов, полученных от беременных животных всех групп.
В плацентах проводилось патоморфологическое исследование, а также оце-
нивали метаболизм NO по концентрации суммарных нитратов и нитритов и нит-
ротирозина, и определяли состояние свободнорадикальных механизмов и антиок-
сидантную активность по показателям биохемилюминесценции и концентрации