диссертации / 12

локализации процесса, степени дифференцировки опухоли и качества приготовления препарата [90].

В последние годы онкоморфология пополнилась новыми знаниями.

Внедрение иммуногистохимического метода значительно повысило уровень диагностики онкологических заболеваний в целом. Метод позволяет не только проводить диагностику опухоли, но и определить прогноз заболевания и чувствительность клеток к химиолучевой терапии

[25, 203, 151, 156].

Все приведенные выше методы позволяют выявлять уже сформированное новообразование. Минимальная масса опухоли, которая может быть визуализирована, составляет примерно 1 г (109 клеток или 30

последовательных удвоений исходной онкологической клетки).

Совместимой с жизнью является опухоль массой не более 1 кг, что составляет 1012 клеток. Следовательно, визуализировать опухоль возможно в периоде между 109 и 1012 клеток, что составляет всего 10 циклов удвоения. Таким образом, опухоль на протяжении 1/4 части жизненного цикла остается недоступной для перечисленных методов диагностики [18].

Согласно современным представлениям о канцерогенезе,

формирование опухоли происходит только в третью стадию - стадию прогрессии. Первые две стадии: инициация и промоция, являются доклиническими, а, следовательно, не диагностированными, хотя процесс трансформации клеток в опухолевые уже запущен, но еще является обратимым [84, 20].

Одним из направлений поиска диагностических методов, которые позволили бы выявлять онкологический процесс еще до формирования визуально наблюдаемого новообразования, стало исследование биологических жидкостей с целью выявления компонентов, указывающих на присутствие в организме пациента злокачественного процесса. Такими компонентам являются продукты измененного метаболизма опухолевых клеток (онкомаркеры). К маркерам злокачественного роста относят

21

вещества различной природы. В их число входит более 200 соединений.

Часть из них специфичны только для одного вида опухоли, другие являются неспецифичными, т.е. встречаются при различных опухолях,

либо продуцируются при заболеваниях неопухолевой природы [140, 21].

Все онкомаркеры можно подразделить на следующие классы:

ассоциированные с опухолью антигены или антитела к ним, продукты распада опухолей белковой природы, гормоны, ферменты, продукты азотистого обмена (креатинин, гидроксипролин, полиамины), нуклеиновые кислоты (свободная ДНК), специфические белки плазмы крови (ферритин,

церуллоплазмин, бета-2-микроглобулин). Концентрация онкомаркеров коррелирует с массой опухоли, ее пролиферативной активностью, а в некоторых случаях – со степенью злокачественности новообразования [60, 154, 165, 227]. Определение опухолевых маркеров позволяет диагностировать опухоль в организме на ранних стадиях, а исследование в динамике дает возможность мониторировать течение заболевания, помогая в выборе тактики лечения. Так, при эффективном лечении отмечается снижения уровня маркера, а нарастание опухолевого маркера свидетельствует о развития заболевания или метастазировании, позволяя обнаружить метастазы за 4-6 месяцев до их клинического проявления.

Однако до сих пор нет ни одного опухолевого маркера, обладающего

100%-й диагностической чувствительностью и 100%-й специфичностью по отношению к какому-либо одному органу. Повышение концентрации онкомаркеров могут наблюдаться и при доброкачественных заболеваниях.

В раннем послеоперационном периоде и при проведении специфической терапии отмечается повышение концентрации онкомаркеров, что обусловлено некрозом ткани опухоли и высвобождением из нее онкомаркеров в кровяное русло. Повысить эффективность диагностики можно путем использования комбинации разных опухолевых маркеров

[65, 189, 170, 198].

22

Применительно к раку гортани установлено повышение концентрации ассоциированного с беременностью альфа-2-гликопротеина (АБГ) в 88%

случаев. Определение же АБГ и альфа-2-макроглобулина (МГ) в крови позволяет обнаружить до 90% рецидивов за несколько месяцев подтверждения диагноза другими традиционными методами [77].

В.Д. Осипов (2006) в своей работе выявил повышение АБГ при предраке и раке, при этом уровень МГ, напротив, снижался. Эффективное лечение приводило к нормализации концентрации обоих белков.

В качестве молекулярных маркеров высокого риска прогрессии и рецидивирования рака гортани, предлагают использовать изменение уровня экспрессии гена контактина (CTTN), картированного на 11 хромосоме,

феномен потери гетерозиготности генов-регуляторов клеточного цикла и онкосупрессоров, делеция которых может инициировать процесс малигнизации [150, 176, 211, 230].

Наиболее перспективным в решении проблемы прогнозирования течения рака, по данным одних авторов, является уровень экспрессии матриксной металлопротеиназы мембранного типа 1 (МТ1-ММР). Другие авторы предлагают использовать в качестве фактора прогноза общей выживаемости больных раком гортани уровень экспрессии гена NF-kB, генов ингибиторов циклинзависимых киназ и циклинов А и Е [153, 193, 212].

В последнее время придается большое значение роли цитокинов в патогенезе опухолевой прогрессии - интерлейкинам, интерферонам,

факторам роста и т.д. Интерлейкины (один из подклассов цитокинов)

включаются во все этапы системного и местного иммунного ответа. При развитии злокачественного процесса имеется угроза нарушения любого из этих этапов. Центральное место в перечне причин развития опухоли принадлежит дисбалансу в системе цитокинов.

Одну из ключевых ролей в онкогенезе имеют провоспалительные цитокины - интерлейкин 1 и 6 (ИЛ-1, ИЛ-6). ИЛ-1 и ИЛ-6 часто

23

продуцируются опухолевыми клетками меланомы, плоскоклеточной карциномы с различной локализацией и др. [9,78].

А.В.Махов (2003), изучая острофазовые регуляторные белки - МГ,

лактоферрин (ЛФ), а также ИЛ1 и ИЛ6, отметил снижение концентрации МГ сыворотки крови при предраке и повышение при раке гортани по сравнению со здоровыми людьми, причем с нарастанием процесса выявлена тенденция к повышению МГ до тех пор, пока идет рост опухоли. В стадии замедления роста опухоли количество МГ приходит к норме. Это объясняется тем, что при росте опухоли происходит не только образование новых опухолевых клеток, но и их разрушение, что сопровождается повышением протеаз и выбросом их в кровеносное русло. Этим же объясняется и нормальные значения МГ у ряда больных с развернутой картиной рака (1/5 всех исследований). Снижение уровня МГ при предраке объясняется его участием в образовании комплексов с различными биологическими факторами,

продуцирующимися в течение воспалительной реакции. Автор делает предположение, что здесь проходит граница воспалительной реакции и процесса малигнизации. После окончания курса лечения рака гортани

(комбинированное) в течение 18 месяцев концентрации МГ оставались повышенными.

По данным тех же исследователей повышение концентрации лактоферрина (ЛФ) в сыворотке крови больных предраком и раком гортани не позволяет дифференцировать эти процессы. С другой стороны, у части больных раком гортани регистрировались нормальные значения ЛФ, что являлось плохим прогностическим признаком, а при высоких показателях ЛФ отмечено более гладкое течение послеоперационного периода, особенно при 3 стадии рака гортани.

Содержание ИЛ 1 в крови при предраке повышается, что объясняется авторами достаточной реактивностью организма, а при раке гортани -

снижается за счет несостоятельного ответа иммунной системы на развивающуюся опухоль. Напротив, содержание ИЛ 6 в крови при предраке

24

понижается, видимо за счет участия его в образовании комплексов с МГ, а

при раке - повышается, т.к. добавляется доза этого интерлейкина,

продуцируемая самими клетками опухоли [74].

Приведенные литературные данные свидетельствуют о том, что ни один из применяемых в настоящее время молекулярных маркеров злокачественного роста при раке гортани не является идеальным.

Существующие методы диагностики не позволяют определить, в какой фазе жизни находится опухоль в момент исследования (рост, стабилизация,

деградация), когда происходит начало метастазирования, т.е. когда метастаз представлен лишь группой клеток. И, наконец, широкому применению молекулярно-генетических методик препятствует их высокая стоимость [38].

Несмотря на появление большого количества новых методов диагностики рака гортани, анализ результатов лечения и показателей смертности от рака гортани, проводимые в США и нашей стране, не выявил улучшения ситуации по данной проблеме [44, 134, 218]. Так, более 60%

новообразований гортани выявляются в III - IV стадиях, только в 23,9%

диагностируется I стадия процесса (чаще это поражение складкового отдела),

арак in situ выявляется в 2,3- 6% случаев [130, 131, 214]. Следствием

поздней диагностики рака гортани является высокая смертность больных в течение первого года после установления диагноза – 33% [57].

Вместе с тем, ведущую роль в успехе лечения и реабилитации больных,

играет ранняя диагностика опухолевого процесса [47, 175, 172]. Если при

начальных стадиях возможно проведение консервативного лечения либо

органосохраняющих операций, то дальнейшее развитие процесса требует проведения комбинированного лечения, включающего хирургическое вмешательство в большем объеме, приводящее к инвалидизации больного

[81]. Еще более важное значение ранняя диагностика имеет у больных старшего возраста, так как сопутствующая комплексная соматическая

патология ограничивает возможности противоопухолевого лечения. Так, при

I-II стадиях рака гортани у 80-86 % больных удается достичь

25

положительного эффекта при лучевой терапии, 5-летняя выживаемость среди этой группы составляет 88-97%, а частота рецидива - 18%. При Т3N0M0

после комбинированного лечения 5-летняя выживаемость достигает 60%,

при Т4 - 34,0% [122, 127, 152].

Другой актуальной проблемой является мониторинг рака гортани в процессе лечения и после его завершения. В этом направлении также активно ведутся поиски новых возможностей [124].

Анализируя все вышеизложенное можно заключить, что на сегодняшний день актуальность проблемы дальнейших исследований в области диагностики и прогнозировании течения рака гортани не вызывает сомнений.

1.4. Значение анализа структур неклеточных тканей человека в

диагностике патологических состояний и оценке эффективности

лечения. Явление кристаллизации жидкостей достаточно давно изучается учеными разных отраслей науки. В 1804 г. ученик М.В. Ломоносова Т.Е.

Ловиц впервые описал два способа анализа химических веществ по их кристаллографическим признакам: «метод микрокристаллических реакций» и метод «выветренных солей» [109]. Но только в 40-50 годы прошлого столетия стали рассматриваться возможности получения диагностической информации из кристаллизатов биологических жидкостей.

Первым в диагностических целях был использован метод тезиграфии.

Суть тезиграфии состоял в том, что при добавлении в биологическую жидкость кристаллообразующего вещества – дигидрата хлорида меди

(CuCl2х2Н20) происходят изменения в нормальном образовании кристаллов. Изменения кристаллов дигидрата хлорида меди оценивали макро- и микроскопически. Впервые голландский ученый Daems в 1965

году обнаружил различия в форме кристаллов дигидрата хлорида меди при добавлении к ней гемолизированой крови здоровых людей и больных с гипертрофией и карциномой простаты. В 1969 г. была опубликована работа М.П. Кузина и А.В. Галкина, применивших этот метод для сортового

26

различия плодов [41]. В дальнейшем стали изучаться возможности применения кристаллографии в медицине для диагностики различных заболеваний, о чем свидетельствует ряд публикаций [85, 126, 138].

И.Л. Теодор и группа исследователей модифицировали тезиграфический метод, предложив метод кристаллических налетов:

биопсийный материал погружался в физиологический раствор на 0-15 мин,

к полученному смыву добавляли дигидрат хлорида меди, пропускали через тонкопористый бензольный фильтр, высушивали в термостате, получая при

этом «кристаллический налет» [126].

В последующем стали исследовать кристаллограммы биологических

жидкостей без добавления кристаллообразующих веществ - нативная кристаллография (107, 7, 33).

Л.В. Савина и соавторы предложили кристаллооптический способ

[107]. Авторы исследовали сыворотку крови в проходящем или поляризационном свете, высушенную под покровным стеклом в термостате

в условиях вакуума. Полученные кристаллограммы сравнивали с

«модельными композитами» (кристаллограммы, приготовленные из сыворотки здоровых людей, обогащенных растворами щавелевой, мочевой кислот, глицина, холестерина и др.). Параллельно исследовали сыворотку тех же больных на содержание щавелевой и мочевой кислоты, креатинина,

холестерина, глицина, кальция стандартными лабораторными методами.

Таким образом были выявлены типовые микровключения при различных нарушениях метаболизма.

В литературе встречается целый ряд публикаций, посвященных изучению процессов, происходящих при дегидратации капли биологической жидкости [101]. Однако данные работы имеют описательный характер и не нашли клинического применения.

С 1986 г. С.Н. Шатохиной стали проводиться исследования структур биологических жидкостей без добавления какого-либо кристаллообразующего вещества. Отправной точкой данной работы

27

явилась закономерность, наблюдаемая в природе при кристаллизации магмы вулканического происхождения, при которой имеют место три стадии образования твердого вещества (при взаимодействии металлов и органических примесей): первая – идеоморфная (идеальный кристалл);

вторая – стадия борьбы; третья – аморфная стадия. Увидеть эти три стадии в виде морфологических структур С.Н. Шатохиной удалось при дегидратации сыворотки крови, разведенной физиологическим раствором хлорида натрия. Дальнейшие исследования, проводимые С.Н. Шатохиной совместно с академиком РАМН, проф. В.Н. Шабалиным позволили изучить процессы, происходящие в капле биожидкости при дегидратации с позиций синергетики – науки, изучающей процессы самоорганизации сложных систем [141, 142]. Авторами впервые было объяснено формирование зон при дегидратации капли биологических жидкостей, определены стандартные условия дегидратации, даны названия методам - метод клиновидной и метод краевой дегидратации, высушенной капле – фация

(от греч. фация – форма), показано значение аутоволновых взаимодействий, происходящих в процессе дегидратации биологических жидкостей в норме и при различной патологии.

Методом клиновидной и краевой дегидратации С.Н. Шатохиной и В.Н. Шабалиным изучены структуры морфотипов более 50 000 образцов различных видов биожидкости: сыворотки крови, мочи, слюны,

цереброспинальной жидкости, влаги передней камеры глаза, слезы,

желудочного сока, желчи, синовиальной жидкости и др.[144]. Ими и их учениками был разработан целый ряд методов диагностики различных патологических состояний, нашедших большое практическое применение в различных областях медицины. Если по поводу теоретического обоснования механизмов дегидратации в капле биожидкости продолжаются активные споры не только между медиками, но и физиками,

то факт специфических изменений фаций биожидкостей при различных патологических состояниях признается всеми исследователями [125,149].

28

Метод краевой дегидратации биологических жидкостей,

позволяющий в течение длительного времени переводить структуру жидкокристаллического вещества в кристаллическую, позволил наблюдать в поляризованном свете морфотипы, сформированные структурами белковых и липидных молекул. Это и есть те структуры, которые являются важнейшими составляющими клеток организма – мембраны, ДНК и других ультраструктур, т.к. известно, что биологическая жидкость представляет

собой лиотропный жидкий кристалл - структурно упорядоченные

растворы различных биологических молекул, в том числе липидов. Липиды

ориентирует молекулу липида в воде и придает раствору двулучепреломляющие оптические свойства (свойство, характерное только для кристаллов).

Существование жидких кристаллов – веществ, одновременно обладающих свойствами жидкости и кристалла, было установлено еще в

1888 г. австрийским ученым-ботаником Ф. Рейнитцером. В последующем было выделено 2 класса жидких кристаллов: однокомпонентных термотропных, обладающих анизотропией (двулучепреломление – свойство, характерное для кристаллов) и лиотропных - жидкостей,

состоящих из двух или более компонентов, являющихся неоднородными

[32]. Любые изменения в процессе жизнедеятельности организма мгновенно проявляются в изменении характера упорядоченности лиотропных жидких кристаллов. При переходе биожидкости в твердую фазу эти изменения становятся доступными для визуального наблюдения.

На сегодняшний день оба метода морфологического исследования биологических жидкостей сформировано в качестве новой диагностической технологии – морфологии биологических жидкостей Литос-система, имеет официальное разрешение для практического использования, налажен выпуск специальных наборов для постановки ее методов [142]. В настоящее время

29

создан НИИ морфологии неклеточных тканей живых систем, а анализ структур неклеточных тканей организма (биологических жидкостей) широко используется специалистами различных отраслей медицины в диагностике заболеваний и контроле эффективности проводимого лечения [5, 31, 97, 110, 128].

Технология «Литос-система» стала изучаться и в диагностике онкологических заболеваний. На сегодняшний день имеются публикации, в

которых анализируются возможности морфологического исследования сыворотки крови в диагностике и оценке степени риска злокачественного роста [143].

Изучение вопросов диагностики, оценки эффективности лечения больных раком гортани с помощью новой диагностической технологии ранее не проводилось. С учетом роста заболеваемости данной патологией нам представилось перспективным оценить возможности метода краевой дегидратации сыворотки крови больных раком гортани в диагностике,

контроле эффективности проводимого лечения и амбулаторном наблюдении онкологических больных после лечения в разных возрастных группах.

30