SRCWFBHKn8

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МУРМАНСКИЙ АРКТИЧЕСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

М.Н. Харламова

ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ РОВ И ВОДНЫЕ РАСТЕНИЯ

МУРМАНСК

2016

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МУРМАНСКИЙ АРКТИЧЕСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

М.Н. Харламова

ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ РОВ И ВОДНЫЕ РАСТЕНИЯ

Монография

МУРМАНСК

2016

1

УДК 574.5:535.372 ББК 28.082+28.571

Х21

Печатается по решению Совета по научно-исследовательской работе и редакционно-издательской деятельности Мурманского арктического государственного университета

Рекомендовано к печати кафедрой естественных наук (протокол № 4 от 20 ноября 2015 г.)

Автор: М.Н. Харламова, кандидат биологических наук, доцент, доцент кафедры естественных наук (ФГБОУ ВО «МАГУ»)

Рецензенты: Г.М. Воскобойников, доктор биологических наук, профессор (ФГБОУ ВО «МАГУ»); В.А. Мухин, доктор биологических наук, зав. лабораторией био-

химии и технологии (ФГБНУ «ПИНРО»)

Харламова М.Н.

Х21 Флуоресценция РОВ и водные растения : монография / М.Н. Харламова. –

Мурманск : МАГУ, 2016. – 123 с.

В монографии рассмотрены особенности структуры спектров флуоресценции и возбуждения растворенного органического вещества культуральных сред и природных вод Кольского полуострова. На обширном экспериментальном материале проанализировано происхождение двух основных полос флуоресценции и доказана ведущая роль водных растений в их формировании. Сделаны предварительные выводы о типах химических соединений, ответственных за флуоресценцию незагрязненных природных вод. Настоящая монография может быть использована студентами университетов, бакалаврами и магистрами, обучающимися по направлениям подготовки «Биология», «Экология и природопользование» и соответствующим программам магистратуры, и предлагается к использованию всем, кто желает пополнить свои знания по данному вопросу.

Печатается в авторской редакции.

2

ВВЕДЕНИЕ

Вопрос о роли растворенного органического вещества (РОВ) в системе экологического метаболизма и биокоммуникации природных вод все двадцатое столетие был предметом широких дискуссий и серьезных обобщений (Лукас, 1964; Хайлов, 1971; Новиков, 1994; Новиков, Харламова,

2000; Pütter, 1924; Krogh, 1931; Lucas, 1949). Значительный вклад водных растений (фитоценоза), и преимущественно прижизненных выделений планктонных водорослей, в формирование качественных и количественных характеристик растворенной органики широко обсуждается в научной литературе и его приоритет не вызывает сомнений. Несколько особняком стоит проблема формирования устойчивой части РОВ как пресных, так и морских вод, именуемой водным гумусом, или, благодаря входящим в его состав окрашенным соединениям, «желтым веществом». В отличие от высокомобильных в окружающей среде соединений типа сахаров, карбоновых кислот и других экзометаболитов водный гумус обладает достаточной консервативностью, позволяющей считать его одной из системных характеристик водоема или водной массы. В то же время его происхождение и химический состав до конца не выяснены. Слабо изученной в настоящее время представляется также связь динамики растворенного органического вещества водоемов с фазами развития фитопланктона, других компонентов гидробиоценозов как при сезонной смене формаций, так и при антропогенных воздействиях. Одна из причин этого – некоторая консервативность

изначительная трудоемкость химических методов анализа общего содержания РОВ (бихроматная, перманганатная окисляемость) и его составляющих (хроматография, молекулярная фильтрация и др.), а также зачастую низкая концентрация определяемых соединений в олиготрофных природных водах. Значительные перспективы в этой области, по нашему мнению, открываются при использовании люминесцентных методов для анализа флуоресцирующей части растворенного органического вещества, обладающих высокой селективностью и чувствительностью.

Вгидрохимии природных вод метод люминесцентного анализа используется при геологоразведочных работах на нефть, анализе загрязнений водоемов промышленными отходами, исследовании процессов превращения органического вещества в почвах.

Достоинства флуориметрических методов становятся решающим доводом в пользу попыток их внедрения в гидробиологические исследования

имониторинг окружающей среды, поскольку они позволяют изучать натуральную природную воду без какой-либо предварительной подготовки (кроме фильтрации). Только при этом условии экспрессность самих измерений флуоресценции дает возможность радикально повысить производительность определений группы органических веществ в воде в целях инди-

3

кации ее качества, в том числе и в зависимости от жизнедеятельности гидробионтов.

В настоящее время можно утверждать, что происхождение ультра- фиолетовой-голубой области спектра флуоресценции природных вод исследовано явно недостаточно. Известно, что эта флуоресценция обусловлена свечением части растворенного органического вещества (Люцарев, 1968; Люцарев, Федосов, 1970; Синельников, 1970; Карабашев, 1987; Синельников, Хмылев, 1987; Kalle, 1962). Как правило, в указанной области в природных водах обнаруживаются две широкие бесструктурные полосы флуоресценции: с пиками около 320 и 425 (463) нм, при длине волны возбуждения порядка 265 (365) нм. Происхождение первой принято связывать с антропогенным загрязнением, а второй – с так называемым «первичным гумусом» (Синельников, Бреусов, 1973; Синельников, Хмылев, 1987). При этом перечисленные исследователи не предпринимали попыток непосредственного изучения связи структуры и интенсивности спектров флуоресценции РОВ с метаболической активностью гидробионтов.

Принимая во внимание большое практическое и теоретическое значение разработки и применения методов экспресс-анализа происхождения, состава и динамики растворенного органического вещества в гидробиоценозах в нашей работе была поставлена цель – исследовать растворенные органические вещества автохтонного происхождения в водной среде на основе структуры и динамики спектров их флуоресценции. В связи с этим был исследован состав флуоресцирующей части растворенного органического вещества вод на основе их спектральных характеристик (спектры флуоресценции и возбуждения). Определен вклад отдельных групп гидробионтов, в частности водных растений, в формирование спектров и динамики флуоресценции водных сред, изучено влияние интоксикации на динамику метаболизма растворенного органического вещества. Предпринята попытка выявить роль автохтонной компоненты в составе растворенного органического вещества на примере природных вод Кольского полуострова.

4

ГЛАВА 1

АВТОХТОННОЕ РАСТВОРЕННОЕ ОРГАНИЧЕСКОЕ ВЕЩЕСТВО ВОДОЕМОВ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ БИОЦЕНОЗОВ

1.1. Факторы химической коммуникации в гидробиоценозах. История вопроса

Вязкость воды выше вязкости воздуха более чем в 50 раз, а плотность – примерно в 900 раз. Диффузия молекул в воде примерно на 4 порядка замедлена по сравнению с таковой в воздухе. Поэтому дистантное распространение химических стимулов осуществляется при переносе водных масс, а шлейфы химических стимулов в воде имеют значительно более четкую струйную структуру, чем в воздухе. Растворимость в воде определяется гидрофильными свойствами молекул и не связана с молекулярной массой. Это расширяет спектр потенциальных химических стимулов в воде по сравнению с воздушной средой (Мантейфель, 1991).

Вопрос о прижизненных выделениях морских организмов был впервые поднят А. Пюттером в 1909 г. Им было высказано мнение о том, что гидробионты питаются преимущественно растворенными органическими веществами, особенно выделениями водорослей. Трофоосмотическая теория Пюттера вскоре стала предметом довольно острой дискуссии (Беклемишев, 1928; Krogh, 1931), затем была на некоторое время забыта, а потом поднята вновь (Цит. по Зернову, 1949). Результаты исследований (Duursma, 1963; Bender et al., 1970; Barber, 1973) показали, что именно растворенные органические вещества оказывают существенное влияние на биопродуктивность водных экосистем.

Расширение методических возможностей науки позволило накопить обширный материал, который дал веские основания для широких обобщений. На основе последних С. Лукас (1964) и К.М. Хайлов (1971) выдвинули гипотезу об экологическом метаболизме у гидробионтов. Это позволило по-новому представить механизм регулирования структуры гидроценозов и формирования качества воды. Своеобразный итог многолетних споров вокруг теории Пюттера подвел один из основоположников современной экологии известный американский ученый Ю. Одум, осторожно заметивший, что «выделяемые наружу продукты клеточного метаболизма и “отходы” процесса разложения, возможно гораздо важнее как химические регуляторы, нежели в качестве обычной пищи» (Одум, 1975, с. 46).

В настоящей главе мы ставили перед собой задачу проанализировать роль экзометаболитов (растворенного органического вещества) не как источников пищи и энергии, используемой на прирост биомассы и дыхание водных организмов, а именно как составляющую непрерывного потока информации, существующего в биоценозах. Под информацией, в данном

5

случае, понимается система химических сигналов, положительных и отрицательных стимулов, регулирующих проявление тех или иных биологических функций и актов жизнедеятельности.

Одним из звеньев проблемы экологического метаболизма у гидробионтов стали «вещества тревоги», или «испуга», обнаруженные К. Фришем в 1938 г. у гольянов (Phoxinus laevis) (Frisch, 1941). Эти вещества образуются в особых колбовидных клетках кожи рыб. Если повредить кожу у одного гольяна, а затем опустить его в воду, то все остальные гольяны через 30–60 с быстро опускаются на дно или прячутся в различные укрытия. Позже выяснилось, что вещества испуга широко распространены у морских и пресноводных рыб. Они обнаружены у рыб из семейств Cyprinidae,

Cobitidae, Catastomatidae, Characidae и др. Причем они вызывали реакцию рыб не только своего, но и некоторых других видов. В зависимости от образа жизни рыбы отвечают на появление вещества тревоги одной из следующих трех реакций: 1) становятся совершенно неподвижными (такая реакция характерна для пескаря, гольяна и других придонных рыб, обладающих защитной окраской); 2) всплывают к поверхности и иногда выпрыгивают из воды; 3) прячутся в различные укрытия.

Вслед за обнаружением присутствия в кожных покровах ряда мирных рыб отпугивающего вещества-репеллента началось изучение его химической природы. Сейчас доказано, что телергон тревоги не относится, как считалось ранее, к птериновым веществам. Предполагается, что он принадлежит к соединениям углеводной природы, содержащим аминогруппы. Установлено, что феромон тревоги имеет молекулярную массу приблизительно 1 000, способен образовывать комплексы с высокомолекулярными соединениями, в слабощелочной среде проявляет свойства аниона (Касумян, Лебедева, 1979).

Впроцессе разработки Б.П. Токиным учения о фитонцидах (1942, 1951, 1967) им было сделано предположение о значительной роли выделений водных растений в жизни водоема, в развитии личинок насекомых и амфибий, в миграции рыб к нерестилищам и т.п. (Цит. по Токину, 1971). При этом термин «фитонциды» рассматривался автором шире его первоначального понимания. Б.П. Токин (1971) указывал и на их стимулирующую, и привлекающую роль.

Вэто же время ряд отечественных ученых на симпозиуме, проходившем в Московском университете 29–30 октября 1968 г., обосновали ведущее значение выделений водных организмов (метаболитов) в формировании биоценозов и определении их структуры (Сиренко и др., 1971; Тамбиев, Телитченко, 1971).

Кроме того, РОВ играет значительную роль в качестве первого звена

всамоочищении водоемов от загрязняющих агентов разнообразного происхождения. Большинство известных органических соединений способны вступать в реакцию комплексообразования с ионами тяжелых металлов.

6

По мнению Ван ден Берга и соавторов (Van den Berg et al., 1979), близкие значения константы комплексообразования (lg K) медь (II)-органических комплексов, полученных для экзометаболитов Anabaena cylindrica,

Navicula pelliculosa, Scenedesmus quadricauda и аналогичных термодина-

мических характеристик озерной воды, свидетельствует о преобладающем вкладе внеклеточных продуктов фитопланктона в суммарную комплексообразующую способность пресных вод, особенно в период «цветения».

Указанные функции РОВ в водной среде определяются разнообразием их химического состава, реакционной способностью, склонностью к комплексообразованию, биологической активностью.

1.2. Содержание РОВ в природных водах и основные источники его поступления в водоемы

Основная масса органического вещества в океанах имеет автохтонное происхождение и образуется в результате жизнедеятельности и отмирания животного, растительного и бактериального населения. В зависимости от типа водоема, плотности населяющих его организмов и их метаболической активности концентрация растворенного органического вещества может быть весьма различной. Концентрация РОВ обычно максимальна в эвтрофных водах прибрежных районов и минимальна в ультраолиготрофных глубинных водах. Особенно значительные количества органических веществ присутствуют в поверхностных пресных водах, где их содержание обычно на порядок превышает содержание органического вещества в морских водах (Бикбулатов, Скопинцев, 1974).

В открытых районах океана органические вещества присутствуют в низких концентрациях 0,3–3,0 мг/л, из которых 10% составляет взвешенное органическое вещество (детрит). Концентрация углерода растворенных органических веществ в разных океанах примерно одинакова и зависит прежде всего от продуктивности вод (табл. 1). В прибрежных районах океана, внутренних морях содержание органических веществ намного больше. Например, в Балтийском море оно составляет 2,7–6,5 мг/л (Израэль, Цыбань, 1989). Причина высоких концентраций в последних случаях кроется, по мнению авторов, в поступлении органического вещества с прилегающего бассейна с реками, ручьями и т.п. (так называемый терригенный сток).

Как следует из монографии Х. Секи (1986), основными химическими компонентами РОВ являются аминокислоты, белки, углеводы и липиды, для которых характерны следующие значения концентрации (мг/л): аминокислоты и белки – менее 0,1; углеводы – от 0,1 до 0,3; липиды – от 0,1 до 0,2. Однако, на фоне многочисленных публикаций результатов исследований, проведенных в том числе и отечественными авторами, данные Х. Секи представляются заниженными.

7

Таблица 1

Среднее содержание растворенного органического вещества в различных по продуктивности районах океана, Соргмг/л (Химия океана, 1979)

Наиболее распространенными и в то же время важными органическими соединениями, которые обычно присутствуют в природных водах, являются углеводы, как простые – моносахариды, так и сложные – полисахариды. Их наличие связано с жизнедеятельностью обитающих в водоемах организмов; они образуются, по мнению некоторых авторов, при распаде их отмерших остатков (Горюнова, 1950; Семенов, 1967). Согласно опубликованным данным, в пресных водах определяли в основном содержание восстанавливающих сахаров. Количество их обычно составляет десятые доли мг/л и более (Семенов и др., 1964; Семенов и др., 1969; Розиноер и др., 1969). Меньше содержится углеводов в морских водах. Так, для Саргассового моря их количество составляет от 0,27 мг/л на поверхности до 0,75 мг/л на глубине 75 м. В более глубоких слоях содержание углеводов составило всего 0,2 мг/л (Walsh, Douglass, 1966). Даже для морской воды, богатой органическим веществом, на шельфе юго-западной Африки В.Е. Артемьев и Г.Н. Батурин (1969) получили от 1,3 до 2,2 мг/л углеводов.

Углеводы накапливаются в воде в наиболее значительных количествах на поздней стадии развития фитопланктона и, особенно, в следующий за ней период массового отмирания. Указанный характер изменения концентраций углеводов также был отмечен во время вспышек диатомовых и жгутиковых водорослей. У зеленых водорослей он существенно отличался: относительно высокое содержание углеводов наблюдалось в течение всего периода их развития и последующего отмирания (Семенов и др., 1974). В какой-то мере это согласуется с результатами исследований Аллена (Allen, 1956) и Левина (Lewin, 1956) на культурах зеленых, показавших, что накопление углеводов в культуральной среде наблюдается на всех стадиях развития этих водорослей.

По данным, представленным А. Крогом в 1935 г., белковые вещества (смесь аминокислот) составляют в РОВ ~ 30% (Цит. по Перлюк, 1977). Показано, что в момент массового развития фито- и зоопланктона в эвфотическом слое Норвежского моря и Северной Атлантики в растворенном ор-

8

ганическом веществе содержится максимум протеиногенных свободных и связанных аминокислот. Их концентрация (плюс глютамин) колебалась от 0,73 до 3,86 мгС/л. В РОВ прибрежной устьевой зоны Баренцева моря содержание свободных и связанных аминокислот достигало 5,3 мгС/л (Пер-

люк, 1977).

В природных водах обнаруживаются также некоторые второстепенные компоненты, такие, как органические кислоты, углеводороды, витамины и гормоны. Концентрация этих соединений в воде достаточно низкая: порядка 10-6–10-9 г/л.

Довольно значительная часть растворенного органического вещества связана в гумусоподобные соединения, устойчивые к биохимическим воздействиям. Вследствие этого лишь не более 10% связанных органических веществ может быть легко доступно в качестве питательного субстрата для водных микроорганизмов. В природных водах гумусовые вещества представляют собой полимеры кислот (Секи, 1986).

Во избежание терминологической путаницы сразу оговоримся, что основу гуминовых (гумусовых) веществ составляют гуминовые кислоты (М.в. 1 300–1 500), которые в свою очередь подразделяются на гумусовые, фульво- и гематомелановые кислоты. Гумусовые кислоты – наиболее темноокрашенная (коричневая), высокомолекулярная фракция. Фульвокислоты имеют, как правило, менее интенсивную окраску (желтую) и меньший молекулярный вес (< 1 000). О гематомелановых кислотах известно, в частности, что они составляют только 2–5% от общего количества гуминовых кислот. В научной литературе встречаются и несколько другие толкования взаимоотношений в группе соединений водного гумуса. Полной ясности в этом вопросе, очевидно, не существует, как не содержится точных данных о химической структуре гуминовых кислот. Гумусовые кислоты и фульвокислоты – это сложная смесь соединений разного состава, свойств и строения. Принято считать, что эти кислоты состоят в основном из конденсированных ароматических ядер. Так же было установлено наличие в них гидроксильных, карбоксильных, карбонильных и ацетогрупп, простых эфирных связей и др. Из природных продуктов они извлекаются водными растворами щелочей, окрашивающимися при этом в темный цвет. В ходе дальнейшей нейтрализации щелочных растворов гумусовые кислоты, в отличие от фульвокислот, выпадают в виде аморфных бурых осадков. В поверхностных водах кислоты могут находиться в растворенном, взвешенном и коллоидном состояниях, что зависит от целого ряда факторов: химического состава воды, значений рН, биологической ситуации в водном объекте и т.д. (Зенин, Белоусова, 1988).

Содержание гумусовых кислот в поверхностных водах обычно составляет десятки и сотни мкг/л. В исследованиях В.А. Генераловой (1974) количество гумусовых кислот в шести северных реках колебалось от 399 до 531 мкг С/л со средним 455 мкг С/л. В многих реках и других водо-

9