новая папка 2 / 47118

Измерение площади ведут планиметром. При отсутствии

планиметра под хроматограмму подкладывают копировальную и миллиметровую бумагу, обводят по периметру пятно зоны ка- рандашом и подсчитывают площадь (мм2) изображений пятен на миллиметровой бумаге. Строят калибровочный график зависимо- сти площади зон от концентрации стандарта (рис. 3) и по графику определяют массу компонента в растворе пробы. Ошибка метода измерения площади зон достигает 5-10%, поэтому метод исполь- зуют для ориентировочных анализов.

Более точен денситометрический метод определения ве- ществ на хроматограммах (ошибка 1-2%). При денситометрии

выполняют измерение оптического поглощения проявленной хроматограммы сканирующим лучом в проходящем или отра- женном свете на специальных приборах — денситометрах. На денситограмме получают пики, площадь которых пропорцио- нальна содержанию вещества в пятне. Построив с помощью стандартов калибровочный график, измеряют площадь пика ком- понента и по графику определяют его массу в пробе.

Получает развитие также спектрофотоденситометрическое и флуориметрическое определение веществ на хроматограммах. В первом случае используют специальные спектрофотоденсито- метры, измеряющие поглощение вещества в монохроматическом свете, во втором измеряют флуоресценцию пятна при облучении хроматограммы УФ-светом.

1.4. Характеристика разделения.

Основные критерии, характеризующие хроматографический процесс, - удерживание, эффективность и степень разделения. Их

определяют по хроматограмме.

Основной качественной характеристикой и параметром ис- пользуемым для определения положения индивидуального веще- ства на ТС-хроматограмме, является величина Rf. Она представ- ляет собой отношение расстояния, пройденного анализируемым веществом, к расстоянию, пройденному фронтом растворителя:

11

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

где na - расстояние, пройденное анализируемым веществом (цен- тром пятна) от места нанесения пробы;

nf - расстояние, пройденное подвижной фазой от места на- несения пробы до фронта растворителя. Граничные условия для Rf = (1 > Rf > 0). При Rf = 0 вещество не движется, остается на старте; при Rf = 1 вещество движется с фронтом растворителя.

Благодаря многочисленным факторам, влияющим на мигра- цию вещества, трудно добиться, чтобы величина Rf была посто- янной, на практике это величина, как правило, варьирует. Чтобы избежать влияния этих флуктуации на результаты, на той же пла- стине в идентичных условиях хроматографируется вещество с за- ведомо известным миграционным поведением (и величиной Rf), которое служит внутренним стандартом. Величина Rf анализи- руемого вещества определяется в этом случае отношением рас- стояния, пройденного анализируемым веществом (na), к расстоя- нию пройденному внутренним стандартом (nst) обозначается как

Rst :

Rst = na nst

В противоположность величине Rf которая всегда < 1, вели- чина Rst может быть > 1. Рис. 6 иллюстрирует определение этих двух параметров.

Рис.6. Схематическое изображение определения величины

Rf (А) и Rst (В)

На поверхности тонкослойной пластины независимо друг от друга идут два конкурирующих процесса. В результате распреде-

ления каждого из компонентов между подвижной и стационарной фазой происходит процесс разделения смеси на индивидуальные компоненты. В то же время пятно (или полоса) каждого компо- нента имеет тенденцию к размыванию. Степень размывания

12

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

пятен определяется эффективностью пластины. Чем выше эффек- тивность, тем компактнее пятно и, соответственно, выше качест- во (разрешающая способность) пластины. Параметр, определяю- щий эффективность пластины, носит название числа теоретиче- ских тарелок (эквивалентные теоретические тарелки) и вычисля- ется по формуле:

где n - расстояние от линии старта (места нанесения пятна) до нижней границы пятна;

m - диаметр пятна, характеризует размывание пятна.

При расстоянии разделения 10 см величина N для ВЭТСХ- пластин может достигать 5000 и более. Для сравнения: колонка для высокоэффективной жидкостной хроматографии длиной 25 см и размером внутреннего диаметра 4,6 мм содержит обычно от 10000 до 25000 теоретических тарелок.

Селективность и эффективность разделения - взаимо- связанные понятия. Если эффективность разделения определяет ширину пятна (пика вещества), то селективность определяет раз- личие Rf для разделяемых веществ. Это иллюстрируется рисун- ком 7.

А - высокая эффектив- ность (высокие пики), но

низкая селективность (вещества недостаточно разделились).

В - низкая эффективность (низкие пики), но хоро- шая селективность.

Рис.7. Различия между эффективностью и селективностью разделения в хроматографическом процессе.

Важное значение в практике имеет взаимное расположение пятен двух разделенных веществ в конкретной ТСХ-системе (с конкретными стационарной и подвижной фазами). От этого зави- сит как селективность, так и эффективность разделения. Соответ- ствующая величина - разрешение - определяется как RS (рис 8):

13

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Рис.8. Определение хроматографического разрешения.

где величины m1,2 - диаметр пятен веществ 1 и 2; d - расстояние между центрами двух пятен.

Другими словами, чем больше расстояние между пятнами и чем меньше диаметр пятен веществ, тем лучше результаты разде- ления. Разрешение считается полным при Rs ~ 1,5, то есть между пятнами остается некоторое расстояние. Максимальное разреше- ние получается при величинах Rf порядка 0,3-0,5.

Впроцессе хроматографии формируются компактные сим- метричные пятна индивидуальных веществ, диаметр которых по- степенно увеличивается с увеличением расстояния, проходимого ими. Размывание пятен обуславливается главным образом диф- фузией, в наибольшей мере зависящей от размера частиц сорбен- та. Размер пластины должен быть рассчитан таким образом, что- бы, несмотря на размывание, пятна всех компонентов оказались в конечном итоге разделенными.

Вхроматографии в зависимости от полярности компонентов хроматографической системы - стационарной и подвижной фаз - различают прямофазовую (нормальнофазовую) и обращеннофа- зовую хроматографию. Если стационарная фаза имеет более вы- сокую полярность, чем растворитель - это прямофазовая хрома- тография, и наоборот, если элюент более полярный, чем стацио- нарная фаза - в этом случае мы имеем дело с обращеннофазовой хроматографией.

14

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

2. Лабораторная работа:

«Определение некоторых хлорорганических пестицидов в воде, продуктах питании, кормах методом хроматографии

в тонком слое».

Цель: Научиться определять хлорорганические пестициды Основные положения. Настоящие методические указания

распространяются на определение содержания ДДТ, ДДЭ, ДДД, гексахлорана, альдрина, кельтана, гептахлора, метоксихлора, дак- тала, тедиона и эфирсульфоната в воде, почве, овощах, фруктах, зерне, комбикормах.

Принцип метода. Метод основан на хроматографии хлор- содержащих пестицидов в тонком слое окиси алюминия, силика- геля или пластинок «Силуфол» в различных системах подвижных

растворителей после экстракции их из исследуемых образцов и очистке экстрактов. Подвижным растворителем служит гексан или гексан в смеси с ацетоном. Места локализации препаратов обнаруживают после опрыскивания пластинок раствором аммиа-

ката серебра с последующим ультрафиолетовым облучением или после облучения ультрафиолетовым светом пластинок «Силу- фол».

Реактивы и растворы. Ацетон х. ч. Аммиак водный х. ч. Натрий сернокислый безводный ч. Натрий углекислый кислый х. ч. Натрий хлористый х. ч., насыщенный раствор. Петролейный эфир (т. кип. 40-70 °С). Перекись водорода х. ч. (30%-ный водный раствор).

Проявляющий реактив: 0,5 г азотнокислого серебра раство- ряют в 5 мл дистиллированной воды, прибавляют 7 мл аммиака и доводят объем раствора до 100 мл ацетоном, в готовый раствор добавляют 0,2 мл перекиси водорода. Раствор следует хранить в колбе с притертой пробкой в темном месте в течение 3 дней. На пластинку 9×12 см расходуется 8-10 мл раствора.

Серебро азотнокислое ч. д. а. Серная кислота ч. Стандартные образцы: ДДТ, ДДД, ДДЭ, альдрин, изомеры

ГХЦГ, гептахлор, метоксихлор, кельтан, эфирсульфонат, дактал,

15

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

тедион х. ч. Стандартные растворы: 10 мг соответствующего пес- тицида растворяют в мерной колбе на 100 мл в гексане и доводят до метки этим растворителем. Стандартные растворы необходи- мо хранить в стеклянной посуде с притертыми пробками в холо- дильнике.

Стеклянная вата, очищенная концентрированной серной ки- слотой, промытая дистиллированной водой и высушенная. Эти- ловый спирт-ректификат. Хлороформ х. ч. Четыреххлористый уг- лерод х. ч. Диэтиловый эфир (для наркоза). Натрий сернокислый, 2%-ный водный раствор. Натрий сернокислый, насыщенный раствор.

Приборы и посуда. Баня водяная. Вакуумно-ротационный испаритель или прибор для отгонки растворителей. Воронки хи- мические диаметром 6 см. Воронки делительные на 100, 250, 500 мл. Гомогенизатор или измельчитель тканей. Камера для опры- скивания. Камеры для хроматографирования размером 150×200, 105×165 мм. Колбы мерные на 50 и 100 мл. Колбы на шлифах ем- костью 100, 250 и 500 мл. Колбы круглодонные на шлифах емко- стью 150, 250 и 500 мл. Микропипетки. Пипетки или шприцы для нанесения проб. Пипетки на 1, 5 и 10 мл. Прибор для встряхива- ния. Пластинки стеклянные 9×12, 13×18 см. Пульверизаторы стеклянные для опрыскивания пластинок. Стеклянные хромато- графические колонки (диаметр×высота, мм) 20×400, 15×150. Ртутно-кварцевая лампа ПРК-4. Цилиндры мерные на 25; 50; 100; 250 и 500 мл. Чашки выпарительные № 3 и № 4.

Пластинки типа «Силуфол UV-254» предварительно промы- вают ацетоном в хроматографической камере, высушивают на

воздухе и непосредственно перед использованием активируют в сушильном шкафу при температуре 65 °С в течение 4 мин.

Ход анализа.

Экстракция и очистка экстракта из воды и вина. Пробу

200 мл помещают в делительную воронку и экстрагируют пести- циды, встряхивая в течение 3 мин, гексаном или петролейным эфиром тремя порциями по 30 мл, или диэтиловым эфиром тремя порциями по 50 мл. В объединенные экстракты насыпают 10 г безводного сернокислого натрия или фильтруют через воронку,

16

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

заполненную на 2/3 сернокислым натрием. Экстракты переносят

в прибор для отгонки растворителей и отгоняют растворитель до объема 0,2- 0,3 мл. В случае необходимости экстракт чистят серной кислотой.

Экстракция и очистка экстракта из овощей и фруктов.

Измельченную пробу 20 г помещают в колбу с притертой проб- кой и проводят экстрагирование пестицидов трижды в течение 15

мин на аппарате для встряхивания гексаном или петролейном эфиром порциями по 30 мл. Объединенные экстракты сушат без- водным сернокислым натрием, переносят в прибор для отгонки растворителей, отгоняют растворитель до объема 0,2—0,3 мл и наносят на пластинку.

Экстракция и очистка экстракта из зерна и грибов. Из измельченных проб отбирают 20 г зерна, 50 г сырых или 10 г су- хих грибов и помещают в колбы с притертыми пробками. Экс- тракцию пестицидов проводят трижды на приборе для встряхи- вания гексаном или петролейным эфиром порциями по 30 мл. Объединенные экстракты переносят в делительную воронку, прибавляют 10 мл насыщенного раствора безводного сернокис- лого натрия в серной кислоте и осторожно встряхивают несколь- ко раз. Отделяют органический слой и повторяют обработку до тех пор, пока кислота не станет бесцветной. Экстракт промывают дистиллированной водой, сушат безводным сернокислым натри- ем и отгоняют растворитель.

Хроматографирование. На хроматографическую пластин- ку на расстоянии 1,5 см от ее края шприцем или пипеткой нано- сят исследуемую пробу в одну точку так, чтобы диаметр пятна не превышал 1 см. Остаток экстракта в колбочке смывают тремя порциями (по 0,2 мл) диэтилового эфира, которые наносят в центр первого пятна. Справа и слева от пробы на расстоянии 2 см наносят стандартные растворы, содержащие 10, 5 и 1 мкг иссле- дуемых препаратов (или другие количества, близкие к опреде- ляемым концентрациям препаратов).

17

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

9

Рис. 10. Схема прибора для концен- рирования экстракта.

Пластинки с нанесенными растворами помещают в камеру для хроматографирования, на дно которой за 30 мин до начала хроматографирования наливают подвижный растворитель. При

использовании пластинок с тонким слоем окиси алюминия или силикагеля в качестве подвижного растворителя применяют гек- сан или смесь гексана с ацетоном (6:1) для препаратов, у которых величина Rf в гексане ниже 0,3. При использовании пластинок «Силуфол» подвижный растворитель –1%-ный раствор ацетона в гексане, а на пластинках «Силуфол» – гексан с диэтиловым эфи- ром (49:1). Край пластинки с нанесенными растворами может быть погружен в подвижный растворитель не более чем на 0,5 см.

Минимально определяемые количества анализируемых со- единений на пластинках с оксидом алюминия − 0,5-1,0 мкг, на пластинках «Силуфол» - 0,2-0,5 мкг.

18

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

После того как фронт растворителя поднимется на 10 см,

пластинку вынимают из камеры и оставляют на несколько минут для испарения растворителя. Далее пластинку орошают прояв-

ляющим реактивом и подвергают действию ультрафиолетового света в течение 10-15 мин (лампа ПРК-4). Пластинки следует располагать на расстоянии 20 см от источника света. При нали- чии хлорорганических пестицидов на пластинке появляются пят- на серо-черного цвета.

Обработка результатов анализа. Количественное определе- ние осуществляют сравнением площадей пятен пробы и стан- дартных растворов. Между количеством препарата в пробе, не превышающим 20 мкг, и площадью его пятна на пластинке суще- ствует прямая пропорциональная зависимость. При большом со-

держании препарата следует использовать пропорциональную часть исследуемого экстракта.

Количество препарата в пробе (X, мг/кг или мг/л) вычисля-

ют по формуле

X = A1S2 PS1

где A1 – содержание препарата в стандартном растворе, мкг; S1 – площадь пятна стандартного раствора, мм2; S2 – площадь пятна пробы, мм2; Р – масса или объем исследуемой пробы, г или мл.

19

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Предел обнаружения методом ТСХ и допустимый уровень содержания ХОП в сельскохозяйственном

сырье и продуктах питания (СанПиН 2.3.2.1078-01).

По окончанию определения хлорорганических пестицидов в воде и продуктах питания студент должен сформулировать вывод о содержании их в исследуемом образце и сравнить с ПДК.

20

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com