Zachet_Abramova

распределены по всему геному и транскрибируются в РНК. К ним относятся гены, контролирующие синтез гистонов, тРНК, рРНК и некоторые другие. Остальные 70% генома мыши представлены уникальными нуклеотидными последовательностями. У растений и амфибий на долю умеренно и высоко повторяющихся последовательностей приходится до 60% генома.

Избыточность генома эукариот объясняется также экзон-интронной организацией большинства эукариотических генов, при которой значительная часть транскрибированной РНК удаляется в ходе следующего за синтезом процессинга и не используется для кодирования аминокислотных последовательностей белков (см. разд.

3.4.3.2).

Характеризуя наследственный материал прокариотической клетки в целом, необходимо отметить, что он заключен не только в нуклеоиде, но также присутствует в цитоплазме в виде небольших кольцевых фрагментов ДНК — плазмид.

Плазмиды — это широко распространенные в живых клетках внехромосомные генетические элементы, способные существовать и размножаться в клетке автономно от геномной ДНК. Описаны плазмиды, которые реплицируются не автономно, а только в составе геномной ДНК, в которую они включаются в определенных участках. В этом случае их называют эписомами.

Впрокариотических (бактериальных) клетках обнаружены плазмиды, которые несут наследственный материал, определяющий такие свойства, как способность бактерий к конъюгации, а также их устойчивость к некоторым лекарственным веществам.

Вэукариотических клетках внехромосомная ДНК представлена генетическим аппаратом органелл — митохондрий и пластид, а также нуклеотидными последовательностями, не являющимися жизненно необходимыми для клетки (вирусоподобными частицами).

Наследственный материал органелл находится в их матриксе в виде нескольких копий кольцевых молекул ДНК, не связанных с гистонами. В митохондриях, например содержится от 2 до 10 копий мтДНК.

Внехромосомная ДНК составляет лишь небольшую часть наследственного материала эукариотической клетки. Например, мтДНК человека содержит 16569 п.н. и на её долю приходится менее 1% всей клеточной ДНК.

Вотличие от хромосомной ДНК, мтДНК характеризуется высокой «плотностью генов». В них нет интронов, а межгенные промежутки невелики. В кольцевой мтДНК человека содержится 13 генов, кодирующих белки (3 субъединицы цитохром С-оксидазы, 6 компонентов АТФазы и др.) и 22 гена тРНК. Значительная часть белков митохондрий и пластид синтезируется в цитоплазме под контролем геномной ДНК.

Если большинство ядерных генов представлены в клетках организма в двойной дозе (аллельные гены), то митохондриальные гены представлены многими тысячами копий па клетку.

Для генома митохондрий характерны межиндивидуальные различия, но в клетках одного индивида, как правило, мтДНК идентична.

Совокупность генов, расположенных в цитоплазматических молекулах ДНК, называют плазмоном. Он определяет особый тип наследования признаков — цитоплазматическое наследование (см. разд. 6.3.2.).

2. Биохимия клеточного цикла. Циклины?

Оказывается, что они находятся в клетках в неактивном состоянии, а для того чтобы они активировались и начали работать, необходимы специальные активаторы. Ими являются циклины. Их также много разных типов, но они присутствуют в клетках не постоянно: то появляются, то исчезают. В разные фазы клеточного цикла образуются разные циклины, которые связываясь с Cdk образуют различные Cdk-циклиновые комплексы. Эти комплексы регулируют разные фазы клеточного цикла и поэтому называются G1-, G1/S-, S- и

21

М-Cdk (рис. из моих рис. циклины). Так, например, прохождение клетки по G1 периоду клеточного цикла обеспечивает комплекс циклин-зависимой протеинкиназы-2 (cdk2) и циклина D1, циклин-зависимой протеинкиназы-5 (cdk5) и циклина D3. Прохождение через специальную точку рестрикции (R-пункт) периода G1 контролирует комплекс cdc2 и циклина С. Переход клетки из G1 периода клеточного цикла в S период контролирует комплекс cdk2 и циклина Е. Для перехода клетки из S периода в G2 период необходим комплекс cdk2 и циклин А. Циклин-зависимая протеинкиназа-2 (cdc2) и циклин В участвуют в переходе клетки из G2 периода в митоз (М период). Циклин H в соединении с cdk7 необходим для фосфорилирования и активации cdc2 в комплексе с циклином В.

Циклины — семейство белков-активаторов циклин-зависимых протеинкиназ (CDK) (англ. CDK, cyclin-dependent kinases) — ключевых ферментов, участвующих в

регуляции клеточного цикла эукариот. Циклины получили свое название в связи с тем, что их внутриклеточная концентрация периодически изменяется по мере прохождения клеток через клеточный цикл, достигая максимума на его определенных стадиях.

Каталитическая субъединица циклин-зависимой протеинкиназы частично активируется в результате взаимодействия с молекулой циклина, которая образует регуляторную субъединицу фермента. Образование этого гетеродимера становится возможным после достижения циклином критической концентрации. В ответ на уменьшение концентрации циклина происходит инактивация фермента. Для полной активации циклин-зависимой протеинкиназы должно произойти специфическое фосфорилирование и дефосфорилированиеопределенных аминокислотных о

статков в полипептидных цепях этого комплекса. Одним из ферментов, осуществляющих подобные реакции, является киназа CAK (CAK — CDK activating kinase).

Билет 15

1. Циклинзависимые киназы

Общая ситуация выгладит так. В клетке постоянно присутствуют специальные белки-ферменты, которые путем фосфорилирования других белков (по остаткам серина, тирозина или треонина в полипептидной цепи), регулируют активность генов, ответственных за прохождение клетки по тому или иному периоду клеточного цикла. Эти белки-ферменты называются циклин-зависимыми протеинкиназами (cdc). Имеется несколько их разновидностей, но они все обладают сходными свойствами. Хотя количество этих циклин-зависимых протеинкиназ может варьировать в различных периодах клеточного цикла, они присутствуют в клетке постоянно, независимо от периода клеточного цикла, то есть они имеются в избытке. Другими словами, их синтез или количество не лимитирует или не регулирует прохождение клеток по клеточному циклу. Однако при патологии, если синтез их нарушен, снижено их количество или имеются мутантные формы с измененными свойствами, то это, конечно же, может повлиять на течение клеточного цикла.

Почему же такие циклин-зависимые протеинкиназы сами не могут регулировать прохождение клеток по периодам клеточного цикла. Оказывается, что они находятся в клетках в неактивном состоянии, а для того чтобы они активировались и начали работать, необходимы специальные активаторы. Ими являются циклины. Их также много разных типов, но они присутствуют в клетках не постоянно: то появляются, то исчезают. В разные фазы клеточного цикла образуются разные циклины, которые связываясь с Cdk образуют различные Cdk-циклиновые комплексы. Эти комплексы регулируют разные фазы клеточного цикла и поэтому называются G1-, G1/S-, S- и М-Cdk (рис. из моих рис. циклины). Так, например, прохождение клетки по G1 периоду клеточного цикла обеспечивает комплекс циклин-зависимой протеинкиназы-2 (cdk2) и циклина D1, циклин-зависимой протеинкиназы-5 (cdk5) и циклина D3. Прохождение через специальную точку рестрикции (R-пункт) периода G1 контролирует комплекс cdc2 и циклина С. Переход клетки из G1 периода клеточного цикла в S период контролирует комплекс cdk2 и циклина Е. Для перехода клетки из S периода в G2 период необходим комплекс cdk2 и циклин А. Циклин-зависимая протеинкиназа-2 (cdc2) и циклин В участвуют в переходе клетки из G2 периода в митоз (М период). Циклин H в соединении с cdk7 необходим для фосфорилирования и активации cdc2 в комплексе с циклином В.

Циклин-зависимые киназы (англ. cyclin-dependent kinases, CDK) — группа белков,

регулируемых циклином и циклиноподобными молекулами. Большинство Циклин-зависимых

22

киназ участвуют в смене фаз клеточного цикла; также они регулируют транскрипцию и процессинг мРНК.

Циклин-зависимые киназы являются серин\треониновыми киназами,

и фосфорилируют соответствующие остатки белков. Известно несколько CDK, каждая из которых активируется одним или более циклинами и иными подобными молекулами после достижения их критической концентрации, притом по большей части CDK гомологичны, отличаясь в первую очередь конфигурацией сайта связывания циклинов. В ответ на уменьшение внутриклеточной концентрации конкретного циклина происходит обратимая инактивация соответствующей CDK. Если CDK активируются группой циклинов, каждый из них как бы передавая протеинкиназы друг другу, поддерживает CDK в активированном состоянии длительное время. Такие волны активации CDK возникают на протяжении G1- и S- фаз клеточного цикла.

Опыты на мышах показали, что ингибирование циклин-зависимых киназ, в частности, CDK5, останавливает развитие поликистоза почек.

2. Какие процессы ведут к рекомбинации генетического материала при мейозе?

Рекомбинация генетическая, реорганизация генетического материала, обусловленная обменом отдельными сегментами (участками) двойных спиралей ДНК.

генетическая рекомбинация - главный фактор непостоянства генома, основа большинства его изменений, обусловливающая естеств. отбор, микро- и макроэволюции.

Различают два основных типа генетической рекомбинации: 1) "законную" (общую, или гомологичную), при которой происходит обмен гомологичными (одинаковыми) участками молекул ДНК; 2) "незаконную" (негомологичную), в основе которой лежит обмен негомологичными участками ДНК.

В основе молекулярного механизма законной генетической рекомбинации лежит принцип "разрыввоссоединение" двух гомологичных молекул ДНК. Этот процесс (его наз. кроссинговер) включает несколько промежуточных этапов: 1) узнавание участков; 2) разрыв и реципрокное (крест-накрест) воссоединение молекул: замена одних цепей гомологичными; 3) устранение ошибок, возникающих в результате неправильного спаривания участков. Точка обмена может возникать на любом участке гомологичных нуклеотидных последовательностей хромосом, вовлекаемых в обмен. При этом в точке обмена обычно не происходит изменения нуклеотидных последовательностей. Точность разрыва и воссоединения чрезвычайно велика: ни один нуклеотид не утрачивается, не добавляется и не превращается в к.-н. другой.

Основой всех предложенных схем генетическая рекомбинация послужила так называемая модель Холлидея, согласно которой генетическая рекомбинация начинается с разрыва только одной из двух цепей спирали ДНК. Вслед за разрывом один конец цепи вытесняется другим концом, который наращивается ДНК-полимеразой. Вытесненный конец разорванной цепи спаривается со второй молекулой ДНК (образуется т. наз. гетеродуплекс), в свою очередь вытесняя там участок одной из ее цепей. В конце концов одиночные гомологичные цепи обмениваются реципрокно. После этого первонач. этапа спаривания две гомологичные спирали ДНК удерживаются вместе благодаря перекрестному обмену цепями-по одной от каждой спирали (см. рис.). Точка перекрестка далее может мигрировать, в результате чего дополнительно образуются или растут гетеродуплексные участки на обеих молекулах ДНК.

Незаконная генетическая рекомбинация имеет выраженный локальный характер. В этом случае весь процесс с его начальным этапом узнавания, который сводит вместе две спирали ДНК, направляется особым рекомбинац. ферментом; спаривания оснований здесь не требуется (даже в тех случаях, когда это все-таки происходит, в процессе участвует не более неск. пар оснований). Интеграция транспозонов, плазмид и

23

умеренных фагов в бактериальный геном может служить примером генетическая рекомбинация этого типа. Подобный механизм существует также и в эукариотич. клетках (см. Мигрирующие генетические элементы).

При незаконной генетической рекомбинации в обмен вступают короткие специфические нуклеотидные последовательности одной или обеих спиралей ДНК, участвующих в этом процессе. Таким образом такая генетическая рекомбинация изменяет распределение нуклеотидных последовательностей в геномесоединяются участки ДНК, которые до этого не располагались в непрерывной последовательности рядом друг с другом. Подобный обмен гетерологич. участками ДНК приводит к возникновению вставок, делеций, дупликаций и транслокаций генетического. материала (см.Мутации).

У эукариот перемещения разных генетич. элементов, сопряженные с незаконной генетическая рекомбинация, осуществляются преим. не в мейозе, когда контактируют парные хромосомы. а во время обычных клеточных циклов (митозе). Незаконная генетическая рекомбинация играет важную роль в эволюционной изменчивости, т. к. благодаря ей осуществляются самые разнообразные, нередко кардинальные, перестройки генома и, следовательно, создаются предпосылки для качеств. изменений в эволюции данного организма.

Билет 16

1. Основные этапы биосинтеза белка

Транскрипция ,постранскрипция, трансляция и посттрансляция.

1.Транскрипция заключается в создании "копии одного гена" - молекулы пре-и-РНК (пре-м- РНК).Происходит разрыв водородных связей между азотистыми основаниями, присоединения к гену-промотору РНК полимеразы, которая "подбирает" нуклеотиды по принципу комплементарности, и антипараллельности. Гены у эукариот содержат участки, содержащие информацию, - экзоны и неинформативные участки - экзоны. В результате транскрипции создается "копия" гена, которая содержит как экзоны, так и интроны. Поэтому молекула, синтезирующаяся в результате транскрипции у эукариот - незрелая и-РНК (пре-и-РНК).

2.Период посттранскрипции он называется процессинг, который заключается в созревании и-РНК. Происходит:

Вырезание интронов и сшивание (сплайсинг) экзонов ( сплайсинг называется альтернативным, если экзоны соединяются в другой последовательности, чем были изначально в молекуле ДНК). Происходит "модификация концов" пре-и-РНК: на начальном участке - лидере (5') образуется колпачок или кэп - для узнавания и связывания с рибосомой, на конце 3' - трейлере образуется polyА (множество адениловых оснований) - для транспорта и-РНК из мембраны ядра в цитоплазму.

Это зрелая м РНК.

3. Трансляция: -Инициация

-связывание и-РНК с малой субъединицей рибосомы -попадание стартового триплета и-РНК - АУГ в аминоацильный центр рибосомы -объединение 2-ух субъединиц рибосомы (большой и малой).

-Элонгация АУГ попадает в пептидильный центр , а в аминоацильный центр попадает второй триплет, потом

две тРНК с определенными аминокислотами поступают в оба центра рибосомы. В случае комплементарности триплетов на и-РНК (кодона) и т-РНК (антикодон, на центральной петле молекулы т-РНК) между ними образуются водородные связи и данные т-РНК с соответствующими АМК "фиксируются" в рибосоме. Между АМК, прикрепленными к двум т-РНК, возникает пептидная связь, а связь между первой АМК и первой т-РНК разрушается.

Рибосмома делает "шаг" по и-РНК ("передвигается на один триплет).

Таким образом, вторая т-РНК, к которой прикреплены уже две АМК, перемещается в пептидильный центр, а в аминоацильном центре оказывается третий триплет и-РНК, куда из цитоплазмы поступает следующая т-РНК с соответствующей АМК. Процесс повторяется...

до тех пор, пока в аминоацильный центр не попадет один из трех стоп-кодонов (УАА, УАГ, УГА), которые не соответствуют ни одной аминокислоте

- Терминация - окончание сборки полипептидной цепи.

Результат трансляции - образование полипептидной цепи, т.е. первичной структуры белка.

4. Посттрансляция приобретение молекулой белка соответствующей конформации - вторичной, третичной, четвертичной структур.

24

Особенности биосинтеза белка у прокариот:

а) все этапы биосинтеза происходят в цитоплазме, б) отсутствие экзон-интронной организации генов, вследствие чего в результате транскрипции образуется зрелая полицистронная м-РНК, в) транскрипция сопряжена с трансляцией,

г) имеется только 1 вид РНК-полимеразы (единый РНК-полимеразный комплекс), тогда как у эукариот 3 вида РНК-полимераз, осуществляющих транскрипцию разных видов РНК.

2. Апоптоз - клеточная гибель. Типы автономного апоптоза

Один из главных отличительных признаков апоптоза — сохранность мембраны, а также фрагментов цитоплазмы, ядра и ДНК. Сохранение целостности цитоплазматической мембраны апоптотических телец позволяет, в отличие от некроза, избежать попадания содержимого клетки (лизосомальных гидролаз и других белков, цитокинов, ионов калия, кальция) в межклеточное пространство и даёт возможность макроорганизму сохранить толерантность к данному, постоянно идущему, процессу.

Все ткани организма имеют свой срок жизни, после истечения которого и прекращения функции они должны погибнуть и на их месте появляются новые, аналогичные погибшим, клетки и ткани. Сроки жизни у разных живых структур различны. Они определены в их геноме, т. е. генетически запрограммированы. Поэтому апоптоз является генетически запрограммированной гибелью клеток. Это важнейший физиологический процесс,

позволяющий организму постоянно сохранять функции своих структур на определенном уровне. Кроме того, в процессе образования новых клеток и внеклеточных структур возникают генетические ошибки, происходят мутации и появляются клетки, отличающиеся от клеток организма. Они должны быть немедленно уничтожены, и их гибель также осуществляется с помощью апоптоза, который является и механизмом генетического контроля синтеза веществ и клеток организма. Таким образом, апоптоз как физиологический процесс протекает непрерывно на протяжении всей жизни человека, и биологический смысл его заключается в поддержании постоянства клеток и тканей организма, т. е. тканевого гомеостаза. С помощью апоптоза происходит инволюция органов и тканей после завершения ими своих физиологических функций, например атрофия вилочковой железы после окончания формирования иммунной системы, атрофия половой системы женщин после завершения детородной функции, атрофия органов и тканей при старении человека и др.

Вместе стем апоптоз может развиваться и в условиях патологии — в тех случаях, когда повреждающие факторы действуют на гены, контролирующие включение программы апоптоза. Обычно это происходит с помощью определенных веществ — цитокинов, различных факторов роста, гормонов, активизирующихся при заболеваниях и функционирующих на молекулярном уровне. Эту особенность апоптоза нередко пытаются использовать в клинике. Например, в онкологии постоянно идет поиск возможностей стимулировать апоптоз в злокачественных опухолях с тем, чтобы активизировать распад опухолевых клеток, и это весьма перспективный путь онкотерапии.

25

Билет 17

1. Схема Жакоба-Моно

Регуляция синтеза у прокариот (Жакоб, Моно).

Выделили у прокариот Оперон: группа структурных и функциональных генов.

Т.е. перед геном (генами), несущим информацию о структуре каких-либо белков (структурные гены), находится группа функциональных генов (которые "отвечают", определяют процесс транскрипции). К функциональным генам относят: генпромотор и ген-оператор и находящийся на некотором расстоянии ген-регулятор.

Какие механизмы регуляции есть у прокариот?

1. Путем индукции.

а) ген-регулятор "отвечает" за синтез белка-репрессора, который, синтезируясь, соединяется с геном-оператором, препятствуя прохождению РНК-полимеразы к структурным генам. --> транскрипция не идет.

б) в случае появления в среде какого-либо вещества, белок-репрессор связывается с ним --> освобождается участок гена-оператора, и РНК-полимераза, связываясь с геном-промотором, перемещается к структурным генам --> транскрипция (а позднее трансляция) осуществляется.

В данном случае синтез белка "активироваля" поступающим веществом, которое названо индуктором, а сам механизм регуляции - регуляция путем индукции (например, лактозный оперон).

2. Путем репрессии

а) ген-регулятор несет информацию и о белке-апорепрессоре, который синтезируется в неактивной форме --> не связывается с геном-оператором,транскрипция осуществляется.

б) в случае увеличения концентрации конечного продукта (синтезируемого белка), он связывается с апорепрессором и образуется активный "комплекс" - голорепрессор (апорепрессор+синтезируемый белок) --> голорепрессор связывается с геном-оператором и препятстувует прохождению РНК-полимеразы от гена-промотора к структурным генам --> транскрипция блокируется.

В данном случае наблюдается "подавление", остановка синтеза конечным продуктом - механизм путем репресии.

Как только концентрация конечного продукта (белка) снижается, в нем возникает необходимость, комплекс голорепрессор распадается --> траскрипция (и трансляция позже) возобновляется.

2. Митохондрии. Биохимия апоптоза

Митохондрии, эти клеточные органеллы с двойной мембраной, обладают собственным геномом и способны автономно размножаться. Внутренняя мембрана образует глубокие складки - кристы. В ограниченном ею пространстве, митохондриальном матриксе, находятся ферменты энергетического метаболизма.

АТФ синтезируется за счет энергии, высвобождающейся при переносе электронов с атомов водорода, образовавшихся при переработке субстратов, на конечный акцептор - кислород. Белки, переносящие электроны, встроены во внутреннюю мембрану митохондрий и образуют электроннотранспортную цепь (ЭТЦ). Ее конечный элемент - цитохром с-оксидаза - передает электроны от цитохрома с на кислород

26

При сильном стрессовом воздействии в цитоплазме резко повышается концентрация ионов Са2+. Если кальциевые депо клетки не справляются с его утилизацией, открывается митохондриальная пора (d= 2.6-2.9 нм). Митохондриальная пора это канал, проходящий через обе ММ, состоит из трех белков: транслокатора адениновых нуклеотидов, порина и бензодиазепинового рецептора.

Когда этот комплекс связывается с Са2+, через мемб. пор ы могут проходить вещества с небольшой мол. массой. Это приводит к падению МП и набуханию матрикса, целостность внешней мембраны нарушается, и из межмембранного пространства в цитоплазму выходят белки апоптоза. Белки апоптоза:

фактор, индуцирующий апоптоз (APOptosis-inducing factor - AIF),

вторичный митохондриальный активатор каспаз (second mitochondria-derived activator of caspases - Smac) и некоторые прокаспазы.

Билет 18

1. Каковы основные принципы регуляции генов у эукариот

Особенности регуляции генов у эукариот: 1)нет оперонной организации генов.2) Гены, определяющие синтез ферментов рассеяны в геноме. 3)Регуляция транскрипции является комбинационной, т.е. активность каждого гена регулируется большим числом генов-регуляторов. (промотор и энхансер) 4)белки-регуляторы контролируют транскрипцию генов, кодирующих другие белки-регуляторы 5)гормоны – индукторы транскрипции 6) процесс компактизации и декомпактизации хроматина 7) обратная связь между процессингом, сплайсингом и экзонинтронной организацией генов – например изменение схемы сплайсинга при синтезе антител.

2. Орбиты клеточного цикла. Корреляция основных физиологических процессов клеточного цикла

Книга итальянского ученого профессора Пьетро Воль-пе посвящена рассмотрению биохимии клеточного цикла. В доступной форме автор излагает общие вопросыбиологии

нормальной и раковой клетки, молекулярной биологиипоследовательных этапов передачи генетической информации (репликации, транскрипции и трансляции). Все эти процессы автор анализирует по стадиямклеточного цикла, рассматривая их в системе временных орбит .

Особое внимание П. Вольпе уделяет проблеме модификации ДНК и ее возможной роли в регуляции транскрипции, а также разбору механизмов вирусной

инфекции ихимиотерапии рака. Небольшой объем книги не позволил охватить все работы по рассматриваемым проблемам в ней представлены и интересно обсуждаются результаты, полученные в основном в лаборатории самого. автора. В книге излагаются также оригинальные молекулярнобиологические концепции и гипотезы П. Вольпеотносительно регуляции процессов передачи генетической информации вклеточном цикле, механизма вирусной инфекции и возможных подходов к химиотерапии рака.

Изучение клеточного цикла базировалось на представлениях цитокинетики, которые к 60 м годам, несмотря на их новизну, уже вполне сформировались.

Рассмотрим схему клеточного цикла, предложенную в 1953 г. Ховардом и Пелком. Сразу после митоза каждая дочерняя клетка является диплоидной и имеет нормальный набор хромосом. Эта клетка должна пройти так называемую фазу, чтобы быть в состоянии: удвоить свою ДНК в течение фазы жизненного цикла. После удвоения ДНК клетка переходит в фазу и находится в тетраплоидном состоянии. В процессе митоза клетка снова делится, причем ее тетраплоидный набор хромосом распределяется поровну между двумя дочерними клетками; в результате этого каждая из новых клеток: начинает цикл, имея диплоидный набор хромосом.

Установлено, что в нормальных тканях организма некоторые клетки, будучи дифференцированными, постоянно делятся. Таковы, например, клетки кишечного эпителия, костного мозга, эпидермиса, эпителия семенных канальцев. Другие же клетки по окончании дифференцировки больше не пролиферируют. Лучшим примером клетки,

27

не способной к делению, может служить нейрон, дифференцировка которого заканчивается сразу после рождения и который сохраняется на протяжении всей жизни человека.

В первой серии целые клетки метили – метионином в течение 30 мин с интервалами 1 ч. После каждого 30 минутного периода из клеток экстрагировали ДНК, очищали ее, гидролизовали до оснований и проводили хроматографию. В

изолированных ядрах метилирование ДНК, прослеженное по включению метки в 5 метилцитозин, оставалось в фазе S таким же, как и в первой серии опытов, а радиоактивность аденина, гуанина и тими – на, которая указывала бы на синтез ДНК, полностью отсутствовала. Таким образом, метилирование ДНК в фазе S клеточного цикла всегда происходило и в отсутствие синтеза ДНК.

Эти результаты весьма существенны. Стало ясно, что в изолированных ядрах, где не могут работать ДНК-поли – мераза и ДНК-лигаза, синтезирующие новую ДНК, ДНКметилаза продолжает действовать, образуя 5 метилцитозин в ДНК-полимере.

Кроме того, из этих экспериментов следовал неожиданный и важный вывод: если в изолированных ядрах не могут синтезироваться новые цепи ДНК, то, значит, метилирование, наблюдаемое в фазе S, происходит только в старых цепях ДНК, т. е. в тех, которые дочерние клетки унаследовали от материнской клетки. Эти результаты, подтвержденные другими исследованиями, явились важным этапом в изучении метилирования ДНК в изолированных ядрах.

Прохождение клетки по всем периодам клеточного цикла строго контролируется. При движении клеток по клеточному циклу в них появляются и исчезают, активируются и ингибируются специальные регуляторные молекулы, которые обеспечивают: 1)

прохождение клетки по определенному периоду клеточного цикла и 2 переход из одного периода в другой. Причем прохождение по каждому периоду, а также переход из одного периода в другой контролируется различными веществами. Сейчас мы попробуем выяснить, что же это за вещества и что они делают.

Общая ситуация выгладит так. В клетке постоянно присутствуют специальные белкиферменты, которые путем фосфорилирования других белков (по остаткам серина, тирозина или треонина в полипептидной цепи), регулируют активность генов, ответственных за прохождение клетки по тому или иному периоду клеточного цикла. Эти белки-ферменты называются циклин-зависимыми протеинкиназами (cdc). Имеется несколько их разновидностей, но они все обладают сходными свойствами. Хотя количество этих циклин-зависимых протеинкиназ может варьировать в различных периодах клеточного цикла, они присутствуют в клетке постоянно, независимо от периода клеточного цикла, то есть они имеются в избытке. Другими словами, их синтез или количество не лимитирует или не регулирует прохождение клеток по клеточному циклу. Однако при патологии, если синтез их нарушен, снижено их количество или имеются мутантные формы с измененными свойствами, то это, конечно же, может повлиять на течение клеточного цикла.

Почему же такие циклин-зависимые протеинкиназы сами не могут регулировать прохождение клеток по периодам клеточного цикла. Оказывается, что они находятся в клетках в неактивном состоянии, а для того чтобы они активировались и начали работать, необходимы специальные активаторы. Ими являются циклины. Их также много разных типов, но они присутствуют в клетках не постоянно: то появляются, то исчезают. В разные фазы клеточного цикла образуются разные циклины, которые связываясь с Cdk образуют различные Cdk-циклиновые комплексы. Эти комплексы регулируют разные фазы клеточного цикла и поэтому называются G1-, G1/S-, S- и М-Cdk (рис. из моих рис. циклины). Так, например, прохождение клетки по G1 периоду клеточного цикла

28

обеспечивает комплекс циклин-зависимой протеинкиназы-2 (cdk2) и циклина D1, циклинзависимой протеинкиназы-5 (cdk5) и циклина D3. Прохождение через специальную точку рестрикции (R-пункт) периода G1 контролирует комплекс cdc2 и циклина С. Переход клетки из G1 периода клеточного цикла в S период контролирует комплекс cdk2 и циклина Е. Для перехода клетки из S периода в G2 период необходим комплекс cdk2 и циклин А. Циклин-зависимая протеинкиназа-2 (cdc2) и циклин В участвуют в переходе клетки из G2 периода в митоз (М период). Циклин H в соединении с cdk7 необходим для фосфорилирования и активации cdc2 в комплексе с циклином В.

Билет 19

1. Особенности организации наследственного материала у про и эукариот

Геном современных прокариотических клеток характеризуется относительно небольшими размерами. У кишечной палочки (Е. coli) он представлен кольцевой молекулой ДНК длиной около 1 мм, которая содержит 4·106 пар нуклеотидов, образующих около 4000 генов. Основная масса ДНК прокариот (около 95%) активно транскрибируется в каждый данный момент времени. Как было сказано выше, геном прокариотической клетки организован в виде нуклеоида — комплекса ДНК с негистоновыми белками (см. разд.

3.5.2.4).

У эукариот объем наследственного материала значительно больше. У дрожжей он составляет 2,3 · 107 п.н., у человека общая длина ДНК в диплоидном хромосомном наборе клеток — около 174 см. Его геном содержит 3·109 п.н. и включает по последним данным 30—40 тыс. генов.

Большой объем наследственного материала эукариот объясняется существованием в нем помимо уникальных также умеренно и высоко повторяющихся последовательностей. Так, около 10% генома мыши составляют тандемно расположенные (друг за другом) короткие нуклеотидные последовательности, повторенные до 106 раз. Эти высоко повторяющиеся последовательности ДНК располагаются в основном в гетерохроматине, окружающем центромерные участки. Они не транскрибируются. Около 20% генома мыши образовано умеренными повторами, встречающимися с частотой 103—105 раз. Такие повторы распределены по всему геному и транскрибируются в РНК. К ним относятся гены, контролирующие синтез гистонов, тРНК, рРНК и некоторые другие. Остальные 70% генома мыши представлены уникальными нуклеотидными последовательностями. У растений и амфибий на долю умеренно и высоко повторяющихся последовательностей приходится до 60% генома.

Избыточность генома эукариот объясняется также экзон-интронной организацией большинства эукариотических генов, при которой значительная часть транскрибированной РНК удаляется в ходе следующего за синтезом процессинга и не используется для кодирования аминокислотных последовательностей белков (см. разд.

3.4.3.2).

Характеризуя наследственный материал прокариотической клетки в целом, необходимо отметить, что он заключен не только в нуклеоиде, но также присутствует в цитоплазме в виде небольших кольцевых фрагментов ДНК — плазмид.

Плазмиды — это широко распространенные в живых клетках внехромосомные генетические элементы, способные существовать и размножаться в клетке автономно от геномной ДНК. Описаны плазмиды, которые реплицируются не автономно, а только в составе геномной ДНК, в которую они включаются в определенных участках. В этом случае их называют эписомами.

29

Впрокариотических (бактериальных) клетках обнаружены плазмиды, которые несут наследственный материал, определяющий такие свойства, как способность бактерий к конъюгации, а также их устойчивость к некоторым лекарственным веществам.

Вэукариотических клетках внехромосомная ДНК представлена генетическим аппаратом органелл — митохондрий и пластид, а также нуклеотидными последовательностями, не являющимися жизненно необходимыми для клетки (вирусоподобными частицами).

Наследственный материал органелл находится в их матриксе в виде нескольких копий кольцевых молекул ДНК, не связанных с гистонами. В митохондриях, например содержится от 2 до 10 копий мтДНК.

Внехромосомная ДНК составляет лишь небольшую часть наследственного материала эукариотической клетки. Например, мтДНК человека содержит 16569 п.н. и на её долю приходится менее 1% всей клеточной ДНК.

Вотличие от хромосомной ДНК, мтДНК характеризуется высокой «плотностью генов». В них нет интронов, а межгенные промежутки невелики. В кольцевой мтДНК человека содержится 13 генов, кодирующих белки (3 субъединицы цитохром С-оксидазы, 6 компонентов АТФазы и др.) и 22 гена тРНК. Значительная часть белков митохондрий и пластид синтезируется в цитоплазме под контролем геномной ДНК.

Если большинство ядерных генов представлены в клетках организма в двойной дозе (аллельные гены), то митохондриальные гены представлены многими тысячами копий па клетку.

Для генома митохондрий характерны межиндивидуальные различия, но в клетках одного индивида, как правило, мтДНК идентична.

Совокупность генов, расположенных в цитоплазматических молекулах ДНК, называют плазмоном. Он определяет особый тип наследования признаков — цитоплазматическое наследование (см. разд. 6.3.2.)

2. Клеточный цикл. Литическая инфекция

Литическая вирусная инфекция

Рассмотрим взаимодействие между РНК-содержащим вирусом и эукариотической клеткой на примере вируса полиомиелита и клеток HeLa. Где может находиться в соответствии с «орбитальной» схемой специфический момент клеточного цикла, удобный для проникновения вируса и успешного развития инфекции?

Легко понять, что не может быть безразлично, в какой фазе вирус проникнет в клетку – в Gi или G2, в М или S. Геометрическая гармония «орбит» должна была бы нарушиться при вмешательстве вируса, проникшего в клетку извне.

По-видимому, геном полиовируса – одноцепочечная РНК, ведущая себя внутри клетки-хозяина как мРНК, – не может не вступать в конкуренцию с клеточными мРНК, например за связывание с рибосомами, необходимыми для его трансляции. Следовательно, «законы» клеточного микрокосма должны измениться, если в клетку проникнет экзогенная мРНК, происходящая не из клеточного ядра, а из внешней среды.

При участии вирусной мРНК в цитоплазме клетки-хозяина образуются белки капсида вирусной частицы в ущерб синтезу клеточных белков. Но как и когда это происходит?

Для ответа на этот вопрос проводились опыты с заражением синхронных культур клеток HeLa вирусом в различные моменты клеточного цикла.

Были получены следующие результаты. Так называемые «ранние события» могут происходить в любой период жизни клетки. Это означает, что мембрана клетки всегда позволяет вирусу

30