Электрофорез в агарозном геле

• Подготовить 2% агарозный гель в IX трис-боратном буфере (пропись 10Х трис-боратного буфера приведена на стр.25-26); в расплавленный раствор агарозы перед заливкой в камеру добавить бромистый этидий до конечной концентрации 0.5 мкг/мл. Толщина геля должна составлять 2.5- 3 мм. После того, как агароза застынет, залить в камеру электрофорезный буфер с бромистым этидием, удалить гребенку, установить электроды.

• По окончании амплификации перенести ПЦР-пробирки в комнату для детекции образцов. Внести в лунки геля по 10 мкл амплификатов, провести электрофорез при напряженности поля ЮВ/см в течение 1-2 часов, в зависимости от размера амплификатов. Пробирки с остатками амплификатов можно хранить при -20°С в морозильной камере, расположенной в этой же комнате.

• Перенести гель на трансиллюминатор и идентифицировать образовавшиеся продукты амплификации относительно положительного контроля или используя продукты рестрикции pBR322 или pUC. При работе с трансиллюминатором нужно всегда использовать защитный экран, так как ультрафиолет вызывает ожог глазной роговицы.

• В случае необходимости гель можно сфотографировать на пленку "Микрат-300", используя оранжевый светофильтр, время выдержки зависит от интенсивности свечения, мощности трансиллюминатора, подбирается экспериментально и находится в пределах 2-10 минут.

• Перенести гель в закрывающейся контейнер для последующего уничтожения.

24

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ

Существует большое количество методик электрофореза в ПААГ. Основным требованием к выбранному методу является достаточное разрешение, что достигается соответствующей разгонкой. Разгонка должна быть такой, чтобы обеспечивать четкую дифференциацию двух соседних аллелей. Для локуса D1S80 рекомендуется использовать гель длиной не менее 32 см. Физические параметры электрофореза -напряжение, ток, продолжительность зависят от размеров электрофоретической камеры, ее конструкции, наличия или отсутствия системы охлаждения и т.д. При выборе величины тока следует учитывать, что при слишком медленном движении фрагментов по гелю может быть весьма ощутим эффект диффузии, что приводит к отсутствию четкости сигнала или даже к исчезновению его по мере прохождения ДНК по гелю. В то же время, слишком большой ток, обеспечивая достаточную скорость движения фрагментов ДНК, вызывает перегревание геля, что может ухудшить результат разделения. Поэтому необходимо выбрать те параметры, которые позволяя проводить разгонку максимально быстро, не оказывают неблагоприятного воздействия на ДНК.

СОСТАВ СМЕСИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПААГ

компоненты	6% ПААГ 14см х 24см х 0.75 мм	7% ПААГ 14см х 24см х 0.75мм	8% ПААГ 14см х 24см х 0.75мм	8% ПААГ 21см х 40см х 0.75мм
30% акриламид	7.5 мл	8.75 мл	10.0 мл	18.7 мл
20% глицерин	13.12 мл	13.12 мл	13.12 мл	25 мл
10% персульфат аммония	0.375 мл	0.375 мл	0.375 мл	0.7 мл
ТЕМЕД	0.0375 мл	0.0375 мл	0.0375 мл	0.07 мл
10ХТББ	3.75 мл	3.75 мл	3.75 мл	7.0 мл
Деионизован-ная вода	12.72 мл	11.47 мл	10.22мл	18.53 мл
Общий объем	37.5 мл	37.5 мл	37.5 мл	70.0 мл

Для приготовления 30 % акриламида необходимо к 29.1 г акриламида добавить 0.9 г бис-акриламида, довести деионизованной водой до 100 мл, хранить в темной бутыли в холодильнике при 4°С.

10ХТББ - матричный раствор (0.89Мтрис-0.89Мборат-0.025МЭДТА) трис-боратного буфера, для его приготовления 108 г триса, 55 г борной кислоты и 9.3 г №₂ЭДТА растворяют в дистиллированной

25

воде, проверяют значение рН и если оно отличается от рН 8.0, то используют 40% NaOH, затем доводят объем буфера до 1 литра. Готовый 10ХТББ можно хранить при комнатной температуре; в качестве рабочего раствора используют 1ХТББ. Этот же буфер используется для проведения электрофореза в агарозном геле.

Быстро, но очень тщательно перемешивают смесь компонентов, не допуская вспенивания и выливают в пространство между стеклами, помещают гребенку. В случае малой толщины геля для заливки его между стеклами удобно пользоваться шприцом с толстой иглой. После полной полимеризации геля (60-90 мин), вынимают гребенку, трижды промывают лунки 1ХТББ, устанавливают пластины в электрофоретическую камеру, наливают электродный буфер (1ХТББ). Вносят в лунки по 12-20 мкл ПЦР-амплифицированной ДНК, по обе стороны от исследуемого набора образцов можно внести маркеры с аллелями разного размера. Электрофорез проводят при 250В/50А в течение 4-х часов для разделения аллелей, отличающихся на 50-70 нуклеотидов и при 130В/30А в течение 18 часов при исследовании аллелей, различающихся на 15-20 нуклеотидов.

ОКРАШИВАНИЕ ПААГ НИТРАТОМ СЕРЕБРА

1. Разбирают камеру для электрофореза, гель переносят в кювету, которую помещают на качающуюся платформу. Промывают гель дистиллированной водой.

2. Заливают гель на 10 мин 10%-ным этанолом (смешивают 1 часть 96% этанола с 9 частями дистиллированной воды), затем спирт сливают.

3. Заливают гель на 6 мин 1%-ной азотной кислотой (добавляют 15 мл 65%азотной кислоты к 985 мл дистиллированной воды), затем кислоту сливают.

4. Ополаскивают гель дистиллированной водой, затем промывают в воде при интенсивном встряхивании в течение 5 мин.

5. На 40 мин заливают гель 0.012 М раствора нитрата серебра (растворяют 2 г AgNO3 в дистиллированной воде, объем доводят до 1 литра), затем раствор сливают. На этом этапе кювета с гелем должна быть закрыта от света.

6. Дважды по 1 мин при интенсивном встряхивании промывают гель дистиллированной водой.

7. К 350 мл охлажденного до 4°С 0.28 М Na₂CO₃ (растворяют 29.7 г Na₂CO₃ в воде, объем доводят до 1 литра), добавляют 175 мкл 37%-ного формальдегида. (Формальдегид окисляется на воздухе, поэтому его необходимо хранить плотно закрытым. рН концентрированного раствора

26

должен быть выше 4.0; если рН становится ниже этого значения, необходимо формальдегид заменить.) Таким охлажденным раствором заливают гель и покачивают его до тех пор, пока не будут отчетливо видны окрашенные фрагменты. Можно использовать свежие порции раствора. Затем проявитель сливают.

8. Чтобы остановить проявление, гель помещают на 1 мин в дистиллированную воду, а затем на 5 мин в 10%-ную уксусную кислоту.

9. Промывают гель в дистиллированной воде в течение как минимум 5 мин.

Окрашенные фрагменты ДНК определяются в геле в виде темно-желтых полос, расположенных на сероватом фоне. После того, как гель окрасился, его помещают на плотную фильтровальную бумагу, фотографируют или сканируют. При необходимости сохранения геля его можно высушить при помоши целлофановой пленки.