Постановка пцр

Так как объем одной пробы в ПЦР составляет от 10 до 100 мкл, удобно предварительно смешать в одной пробирке все компоненты реакционной смеси, за исключением анализируемого генетического материала и минерального масла. В следующей таблице представлена схема расчета постановки ПЦР объемом 25мкл для амплификации фрагмента гена pY(D17S30):

Компоненты	исходная концентрация	необходимая концентрация в пробе	количество мкл на 1 пробу объемом 25 мкл	количество мкл на 5 проб	количество мкл на 10 проб
1. Н2О			11.8	59	118
2. dNTP	2.0 мМ	0.2 мМ	2.5	12.5	25
3. MgCl2	40 мМ	1.6 мМ	1.0	5	10
4. 5Хбуфер	5Х	IX	5.0	25	50
5. Taq	5 ед/мкл	1ед	0.2	1	2
6. праймеры	5 мкМ	0.5 мкМ	2.5	12.5	25
7. ДНК			2	добавляется в каждую пробирку индивидуальный образец по 2 мкл

Праймеры для амплификации участка гена pY(D17S30): 5 '-CGAAGAGTGAAGTGCACAGG-3' 5 '-С ACAGTCTTTATTTCTTCAGCG-3'

1. Рассчитать состав реакционной смеси на количество анализируемых проб + две пробы для отрицательного и положительного контролей + 1 проба, учитывающая возможную неточность автоматических пипеток.

2. Пронумеровать одноразовые пробирки для ПЦР (объемом на 0.2 или 0.5 мл). Количество пробирок соответствует числу анализируемых проб + две пробирки для отрицательного и положительного контролей.

3. Внести в пробирку компоненты реакционной смеси в следующей последовательности: деионизованная вода, dNTP, MgCl₂, 5Хбуфер, Taq-полимераза. При переходе от одного компонента к другому обязательно менять наконечники. Тщательно перемешать пипетированием, избегая вспенивания и образования аэрозолей. Добавить праймеры и еще раз осторожно перемешать содержимое пробирки.

22

4. Приготовленную реакционную смесь разлить по 23 мкл в пронумерованные пробирки для ПЦР.

5. В отрицательный контроль добавить 2 мкл дистиллированной воды.

6. В анализируемые пробы добавить по 2 мкл анализируемых образцов генетического материала, перемешать наконечником. При переходе от одной пробирке к другой обязательно менять наконечник.

7. Добавить по 1 капле минерального масла (объемом 30-40 мкл), масло осторожно наносится на стенку пробирки, при этом наконечник не должен касаться стенки пробирки. Тщательно закрыть пробирки.

8. В положительный контроль под слой масла добавить образец контрольной ДНК, сбросить наконечник.

9. Поставить пробирки в амплификатор.

Ю.Включить выбранную программу амплификации. При использовании модифицированной ДНК-полимеразы на первом этапе необходимо прогреть пробы 3 мин при 94 "С для активации полимеразы, затем запустить программу. Например, для амплификации участка гена pY используется следующий температурный режим: 94 °С - 1 мин; 51 °С -1.5 мин; 72 °С - 2 мин, количество циклов - 35.

ОЦЕНКА ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ

Смесь амплифицированных фрагментов ДНК, образовавшуюся в результате ПЦР анализируют с помощью электрофореза в агарозном или полиакриламидном гелях (ПААГ). Выбор метода электрофореза определяется следующими обстоятельствами: ПААГ обладает большей разрешающей способностью, чем агарозный, поэтому ПААГ предпочтительнее использовать при исследовании локусов, в которых близкие аллельные варианты имеют лишь незначительную разницу в длине последовательностей. Например, соседние аллели локуса АроВ отличаются друг от друга только на 16 нуклеотидов и поэтому результат их разделения в агарозном геле буде нечетким, в этом случае предпочтительнее использовать ПААГ. В то же время аллели локуса D1S80 отличаются друг от друга на 70 нуклеотидов и поэтому могут быть легко дифференцированы в агарозном геле. Теоретически целесообразно при типировании любого локуса начинать с пробного электрофоретического разделения в агарозном геле. Результаты его позволяют сориентироваться и определиться в необходимости проведения более сложного и трудоемкого электрофореза в ПААГ. Пробный электрофорез предназначен прежде всего для того, чтобы удостовериться, что в исследуемых объектах выявляются амплифицированные фрагменты и что данная ПЦР-система работает специфично. Результат реакции может позволить сделать вывод и без дополнительного исследования с

23

помощью ПААГ. При необходимости лучшего разделения амшшфикатов для уточнения результатов следует дополнить исследование гель-электрофорезом в ПААГ с последующим окрашиванием бромистым этидием или серебром. В том случае если ПЦР проводится с диагностической целью для исследования наличия или отсутствия чужеродного генетического материала, то проводится электрофорез в 2%-агарозном геле. По окончании электрофореза можно судить о присутствии в анализируемом образце исследуемой ДНК.