Методы исследования клеток

На первом этапе развития цитологии единственным способом изучения клетки было световое микроскопирование.

Микроскоп – это прибор, позволяющий получить увеличенное изображение мелких объектов, не видимых невооруженным глазом. В микроскопии принято использовать следующие единицы длины:

микрометр (1 мкм – 10^-6 м); нанометр (1 нм – 10^-9 м); ангстрем (1Å – 10^-10 м).

●Световая микроскопия основана на том, что через прозрачный или полупрозрачный объект исследования проходят лучи света, попадающие затем в систему линз объектива и окуляра. Линзы увеличивают объект исследования. С помощью световых микроскопов была открыта клетка и некоторые её структуры (ядро, клеточная стенка, пластиды, вакуоли).

●Электронная микроскопия даёт возможность детального изучения клеточных структур. Этот метод позволяет увидеть составные компоненты клеток размером до 0,1 нм, например, биологические мембраны (толщина 6^–10 нм), рибосомы (диаметр около 20 нм).

Преимущество электронного микроскопа:

1) высокое разрешение (0,5 нм на практике).

Недостатки электронного микроскопа:

1) подготовленный к исследованию материал должен быть мертвым, так как в процессе наблюдения он находится в вакууме;

2) трудно быть уверенным, что объект воспроизводит живую клетку во всех ее деталях, поскольку фиксация и окрашивание исследуемого материала могут изменить или повредить ее структуру;

3) дорого стоит и сам электронный микроскоп, и его обслуживание;

4) подготовка материала для работы с микроскопом отнимает много времени и требует высокой квалификации персонала;

5) исследуемые образцы под действием пучка электронов постепенно разрушаются. Поэтому, если требуется детальное изучение образца, необходимо его фотографировать.

Сравнение электронного и светового микроскопов

Параметр	Электронный микроскоп	Световой микроскоп
Источник излучения	электроны	свет
Длина волны	0,005 нм	400-700 нм
Максимальное полезное увеличение	х2500	х1500
Максимальное разрешение	0,2 нм	200 нм
Линзы	электромагниты	стеклянные
Объект	не живой, обезвоженный, маленький или тонкий	живой или неживой
Красители	содержат цветные металлы, которые отражают электроны	цветные

●Метод дифференциального (разделительного) центрифугирования применяется для выделения и изучения отдельных компонентов клетки. Разрушенные клетки помещают в центрифугу, где пробирки с клеточным материалом вращаются на очень высокой скорости.

Разные клеточные структуры имеют различные массу, размеры и плотность, поэтому под действием центробежной силы в растворах определённых веществ (например, сахарозы или хлорида цезия) они оседают с разной скоростью и останавливаются в определённом слое жидкости, что даёт возможность отделить одни компоненты клетки от других.

●Методы цитохимии и гистохимии используются для изучения локализации отдельных химических веществ в клетках. Эти методы основаны на избирательном действии реактивов и красителей на определённые химические вещества, содержащиеся в той или иной клеточной структуре.

●Метод авторадиографии позволяет проследить за каким-либо химическим веществом в клетке. Для этого в молекулы вещества вводят радиоактивную метку (заменяют один из атомов на радионуклид), а затем устанавливают локализацию вещества с помощью счётчика радиоактивных частиц или по засвечиванию фотоплёнки.

●Метод рентгеноструктурного анализа даёт возможность определять пространственное расположение атомов и их группировок в молекулах (например, ДНК, белков), входящих в состав клеточных структур.

●Метод клеточных культур представляет собой выращивание клеток многоклеточных организмов на питательных средах в контролируемых условиях и используется для изучения процессов деления клеток, их дифференцировки и специализации.

●Методы микрохирургии (удаление отдельных клеточных компонентов, их пересаживание из одних клеток в другие, микроинъекции различных веществ и т. д.) применяется для исследования живых клеток, выяснения функций отдельных органоидов и др.

●Замедленная кино- или видеосъёмка через мощные световые микроскопы позволяет проследить за процессами, происходящими в живой клетке в течение длительного времени.