Биотехнология лекарственных препаратов и GMP

дами производства (рога, копыта, волосы, перья, пух, состоящие из кератина, в котором содержится очень много серосодержащей аминокислоты цистеина, и в небольших количествах – других аминокислот).

Следующий способ получения аминокислот – химический синтез. Осуществление самого синтеза достаточно простое, но при этом образуются D- и L-изомеры. Как известно, в белках человека активен лишь второй. При разделении изомеров возникают трудности. Так же процесс химического синтеза протекает при повышенных температурах, требует дорогостоящих катализаторов и сопровождается образованием большого количества отходов.

По сравнению с предыдущим, более приемлемым можно считать химико-энзиматический способ. Этот метод предполагает два этапа:

−химический синтез предшественника (карбоновая кислота)

−биотрансформация – превращение в соответствующую аминокислоту, осуществляемое ферментами живых клеток.

При этом полученные L-стереоизомеры аминокислот сами по себе необходимы для жизнедеятельности этих клеток, т.е. этот способ наполовину биотехнологический.

Оборудование, материалы и реактивы

−термостат;

−спектрофотометр СФ-21;

−ферменты: пепсин, трипсин, химотрипсин;

−пробирки на 14 мл.

Проведение испытания

Образцы раствора белкового субстрата необходимо подвергнуть действию ферментов. Для этого в 3 пробирки налить по 5 мл раствора белкового субстрата, затем в каждую добавить по 1 мл водного раствора фермента с концентрацией 1 мкг/мл: в пробирку № 1 – пепсин, №2 – трипсин, №3 – химотрипсин. Выдерживать пробирки в вертикальном положении в термостате при температуре (37±1)ºС в течение 1 часа. Данные записать.

11

Полученные образцы ферментативных гидролизатов с предполагаемым наличием определенных аминокислот оценивают по уровню оптической плотности на СФ-21 при длине волны 280 нм. Для этого в кювету с расстоянием между гранями 3 мм наливают образец ферментативного гидролизата; пробой сравнения в каждом определении служит исходный раствор белкового субстрата.

Контрольные вопросы

1.Какими способами получают аминокислоты?

2.Какой способ получения аминокислот, по вашему мнению, является полностью биотехнологическим?

3.Какие микроорганизмы являются основными продуцентами аминокислот?

4.Какие известны методы для подтверждения присутствия аминокислот в продуктах?

5.Опишите методику оценки качественного состава аминокислот в исследуемом препарате.

12

РАБОТА № 3 ТЕХНОЛОГИЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТА

ПРИРОДНОГО ИНТЕРФЕРОНА. ИЗГОТОВЛЕНИЕ СУППОЗИТОРИЕВ И МАЗЕЙ В УСЛОВИЯХ ЛАБОРАТОРИИ

Цель работы: знакомство с технологическим процессом получения препарата природного интерферона на базе Пермского НПО «Биомед». Аппаратурное оформление отдельных технологических стадий (по заданию преподавателя).

Основные теоретические сведения

Интерферон – низкомолекулярный гликопротеид, содержащий распространенные аминокислоты и небольшое количество углеводов, включая глюкозамин. Известно три вида интерферонов: альфа-, бета- и гамма-интерферон. Альфа- и бета-интерфероны близки структурно, синтез индуцируется вирусами соответственно в лейкоцитарных и фибробластных клетках, в отличие от гамма-интерферона, синтез которого начинается только после контакта Т-лимфоцитов со специфическими антигенами имитогенами.

В настоящее время технология получения природного интерферона предполагает использование в качестве вирусов-интерфероногенов вирус Сендай или вирус болезни Ньюкасла. В процесс получения интерферона обязательно включают стадию прайминга – предобработку «чистых» лейкоцитов малыми дозами интерферона. В результате этого после вирусной индукции интерферон начинает синтезироваться с большей скоростью по сравнению с процессом, исключающим стадию прайминга.

13

Лейкоэритромасса из крови доноров

Стадия фракционирования

Чистые лейкоциты

Стадия «прайминг» (добавление интерферона)

Стадия индукции (добавление вируса индуктора)

Центрифугирование (смена питательной среды)

Стадия биосинтеза

Центрифугирование при t = 8–10 ºC

Полуфабрикат интерферона

Рис. Схема технологии получения человеческого лейкоцитарного интерферона

Использование вирусного материала в процессе синтеза интерферона предполагает повышенные требования к качеству препаратов интерферона. Проводятся многостадийные процессы инактивации вируса, очистки полученного препарата от примесей веществ, добавляемых в процессе биосинтеза.

В настоящее время на основе альфа-интерферона изготавливают различные лекарственные формы: суппозитории, мази, таблетки. Разработка технологии приготовления мазей, содержащих человеческий лейкоцитарный интерферон, является весьма актуальной ввиду большой биодоступности специфического начала для лечения и удобства применения.

14

Универсальной лекарственной формой интерферона, оказывающей не только местное, но и системное действие, являются суппозитории. Интерферон из суппозиториев всасывается в нижней части прямойкишки и легко проникает непосредственно вкровяноерусло.

Приготовление таблеток выгодно отличается от других лекарственных форм возможностью полной механизации процесса и высокой точностью дозировки. Они удобны для транспортировки и хранения. Важным аргументом в пользу таблетированной формы интерферона является пероральное введение, так как в ротовой полости отсутствуют протеолитические ферменты, влияющие на специфическую активность интерферона.

Контрольные вопросы

1.Классификация и определение интерферона.

2.Опишите биологические свойства природного интерферона.

3.Охарактеризуйте основные технологические этапы получения природного интерферона.

4.Каковы основные характеристики феномена «прайминг»?

5.Какие лекарственные формы на основе интерферона известны? Сравните эти формы.

Изготовление суппозиториев в условиях лаборатории

Суппозитории – твердые при комнатной и расплавляющиеся или растворяющиеся при температуре тела дозированные лекарственные формы. Суппозитории применяются для введения в полость тела. В зависимости от строения и особенностей этих полостей суппозиториям придают соответствующие геометрические очертания и размеры. Различают суппозитории ректальные, или свечи, вагинальные и палочки.

Следует обратить внимание на то, что в суппозиторной форме лекарственные вещества и основа будут занимать разные объемы. Поэтому для расчета количества основы следует использовать заместительный коэффициент (Еж), который равен количеству лекарствен-

15

ного вещества, занимающему объем, равный объему, занимаемому 1 г основы с плотностью 0,95 г/см3. На практике удобнее пользоваться обратным заместительным коэффициентом (1/Еж), который равен количеству жировой основы, занимающему объем, равный объему, занимаемому 1 г лекарственного вещества. Коэффициенты Еж и 1/Еж для некоторых веществ приведены в специальных таблицах.

Количество жировой основы, необходимое для приготовления суппозиториев методом выливания, рассчитывают по формуле

М = Рn – (A¹1/Еж + А2 1/Еж2 + … + Аn1/Ежn,

где М – общее количество суппозиторной основы, г; Р– вес суппозиторной основы, помещающейся вгнездо формы, г; n – количество суппозиториев;

1/Ежn – обратный заместительный коэффициент, г;

Аn – количество лекарственного вещества, необходимое для приготовления всех суппозиториев по данному рецепту, г.

Общие положения о составе, размерах, обязательных свойствах и технологии суппозиториев изложены в общей статье Государственной фармакопеи XI издания.

Оборудование, материалы и реактивы

−холодильник бытовой;

−весы аналитические;

−ступка фарфоровая с пестиком;

−шпатель металлический;

−ковшик алюминиевый для разлива суппозиторной массы;

−металлические или пластиковые прессформы;

−водяная баня термостатируемая;

−стерильные суппозиторные основы: масло какао или витепсол

W-15,W-35;

−шпатель.

16

Проведение испытания

Приготовить суппозитории методом выливания. Для изготовления 10 штук суппозиториев необходимо взять:

1)порошок интерферона человеческого лейкоцитарного с суммарной активностью не менее 40000 МЕ;

2)суппозиторной основы: до 15,0 г.

Интерферон человеческий лейкоцитарный сухой хорошо растворяется в воде и жировых основах, поэтому его вносят в суппозиторную основу в виде порошка. В ступку помещают лекарственную субстанцию, добавляют расплавленную, стерильную суппозиторную основу (масло какао или витепсол W-15,W-35) и перемешивают до образования однородной массы (пульпы). Контроль за равномерным распределением порошка интерферона в расплавленной основе осуществляют визуально по достижении однородной окраски суппозиторной массы. Перемешивание суппозиторной массы необходимо проводить медленно, исключая внедрение пузырьков воздуха, что ведет к образованию пористых, ноздреватых суппозиториев.

Приготовленную суппозиторную массу разливают через носик алюминиевого ковшика в гнезда металлической или пластиковой прессформы. Для постоянного поддерживания температуры (38±2)о С емкость для расплавления суппозиторной массы нагревают на водяной бане. Прессформу выдерживают в течение 30–60 секунд при комнатной температуре. При помощи скальпеля с поверхности прессформы снимают излишки суппозиторной массы в емкость для расплавления основы.

Заполненные формы с суппозиторной массой помещают в морозильную камеру бытового холодильника для формования суппозиториев. Охлаждение форм проводят в течение 15–20 минут при температуре минус (12 ± 2) °С.

После охлаждения полученные суппозитории осторожно вынимают из прессформы и отбраковывают по внешнему виду: суппозитории должны иметь одинаковую торпедообразную форму, однородную белую или кремовато-белую окраску без каких-либо вкрапле-

17

ний, не должно быть сколов или трещин. Кондиционные суппозитории помещают в стерильную кассету, закрывают металлической крышкой и передают на стадию фасовки в бокс фасовки лекарственных форм. Некондиционные суппозитории (со сколами, наплывами, трещинами) передают на операцию расплавления и повторного изготовления суппозиториев.

Обработка результатов

Качество суппозиториев оценивают по следующим критериям:

1.Органолептический контроль: соответствие цвета, запаха суппозиториев свойствам их компонентов.

2.Проверка однородности, соответствие размеров, формы суппозиториев:

−осмотр суппозиториев (должны быть одинаковой формы, размеров);

−на одном из суппозиториев делают продольный срез (не должно быть блесток, вкраплений; допускается наличие воздушного стержня или воронкообразного углубления).

3. Отклонение в массе суппозиториев: взвешивают 10 суппозиториев с точностью до 0,01 г; рассчитывают среднюю массу одного суппозитория и процент отклонения в массе каждого суппозитория от среднего значения. Отклонения в массе не должны превышать

±5 %; только для двух суппозиториев допустимо отклонение ±7,5 %. 4. Определение температуры плавления суппозиториев, изготовленных на липофильных основах. Температуру плавления определяют для суппозиториев, расплавляющихся в полостях организма (ГФ ХΙ. Вып.1. С. 11). Проводят два определения. Температура плавления не должна быть выше 37°С. Расхождение между двумя опре-

делениями не должно превышать 1°С.

5. Время полной деформации определяют для суппозиториев, плавящихся в полостях тела, для которых невозможно определить температуру плавления (ГФ ХΙ. Вып. 2. С. 153). Время полной деформации суппозиториев не должно превышать 15 минут.

18

6. Время растворения суппозиториев, изготовленных на гидрофильных основах, определяют для суппозиториев, растворяющихся в полостях организма (ГФ ХΙ. Вып. 2. С. 152 ). Суппозиторий помещают на дно сосуда вместимостью 200 мл, содержащего 50 мл воды с температурой (37±1)°С. Сосуд через каждые 5 минут взбалтывают так, чтобы жидкость и проба приобрели вращательное движение. Суппозиторий должен раствориться в течение 1 часа.

Контрольные вопросы

1.Обоснуйте необходимость и преимущества использования суппозиториев в медицинской практике.

2.Перечислите требования, предъявляемые к основам для суппозиториев. Приведите классификацию основ.

3.Какое оборудование используютв производстве суппозиториев?

4.На чем базируется рациональный выбор способа изготовления суппозиториев? Каковы достоинства и недостатки этих методов?

5.Какие основы могут быть использованы для изготовления суппозиториев методом выливания? Дайте их характеристику (химическая природа, свойства, достоинства, недостатки).

6.Как определить среднюю массу суппозиториев и время растворения суппозиториев на гидрофильных основах?

7.Как осуществляется процесс формирования суппозиториев?

Приготовление мазей в условиях лаборатории

Мазь – мягкая лекарственная форма, предназначенная для нанесения на кожу, рану или слизистые оболочки. Мази состоят из основы и одного или нескольких лекарственных веществ, равномерно в ней распределенных. В состав мазей могут входить стабилизаторы, ПАВ, консерванты и другие вспомогательные вещества.

Требования, предъявляемые к мазям, обусловлены как способом применения, так и сложностью состава этой лекарственной формы. Мази должны иметь мягкую консистенцию, обеспечивающую удобство нанесения их на кожу и слизистые оболочки и образование на поверхности ровной сплошной пленки. Для достижения необходимо-

19

го терапевтического эффекта и точности дозирования лекарственные вещества в мазях должны быть максимально диспергированы и равномерно распределены по всей массе мази. Кроме того, мази должны быть стабильны, не содержать механических включений. Их состав не должен изменяться при применении и хранении.

К мазевым основам предъявляется ряд требований: мягкая консистенция необходима для удобства нанесения на кожу и слизистые оболочки; химическая инертность основ, гарантирующая отсутствие взаимодействия с лекарственными веществами, изменения под действием внешних факторов (воздух, свет, влага, температура), обеспечивает стабильность мази; отсутствие аллергизирующего, раздражающего и сенсибилизирующего действия мазей во многом зависит от биологической безвредности основ. Важно также, чтобы основы не нарушали физиологических функций кожи (тепло-, влаго- и газообмена). Известно, что наружный слой кожи (эпидермис) в норме обладает кислой реакцией, которая препятствует размножению микроорганизмов. Поэтому требование нейтральности мазевых основ, сохранениепервоначального значения рНкожи имеют большоезначение.

Изготовление мазей состоит из нескольких последовательных стадий: плавление, растворение, диспергирование, при необходимости эмульгирование, упаковка, оформление. Кроме того, осуществляется контроль отдельных стадий (полнота растворения, однородность смешивания и т.д.), а также оценка готовой мази по технологическим показателям качества.

Качество мази оценивают по тем технологическим показателям, которые являются общими для всех лекарственных форм. Весьма важными специфическими показателями качества являются однородность и размер частиц лекарственных веществ в суспензионных и комбинированных мазях. В ГФ X введена методика определения размера частиц лекарственных веществв мазях спомощью микроскопа.

Для оценки дисперсности мази с концентрацией веществ выше 10 % мазь предварительно разбавляют соответствующей основой до 10 % содержания и перемешивают, избегая измельчения частиц. В зависимости от вида основы расплавленную навеску мази (0,05 г)

20