2. Турбидиметрия.

Метод анализа, основанный на , называют турбидиметрией. Этот метод характеризуется достаточно высокой чувствительностью, легким внедрением в рабочий процесс лабораторий за счет простоты и высокой скорости проведения анализов, легкой адаптацией к большинству полуавтоматических и автоматических биохимических анализаторов. Для иммунотурбидиметрии необходимо построение калибровочного графика с использованием нескольких концентраций калибратора, так как калибровочный график имеет нелинейный характер.

Нефелометрия и иммунотурбидиметрия примерно равноценны по чувствительности, специфичности, трудоемкости и стоимости исследования.

Поэтому выбор между ними, как правило, определяется обеспеченностью соответствующими приборами и высокоспецифичными наборами реагентов. Серийность и автоматизация исследований делает эти методы оптимальными для больших и средних лабораторий, выполняющих десятки и сотни анализов в день.

3. Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (ИФА) – представляет собой высокочувствительный метод иммунохимического анализа на основе ферментсвязанного иммуносорбента, используемый для определения специфических антигенов в сложной смеси. Он основан на использовании стандартных препаратов очищенных антигенов или антител, ковалентно связанных с ферментом. Эти препараты сохраняют и иммунологические свойства, и ферментативную активность, которую можно измерить при добавлении субстрата данного фермента. ИФА в различных модификациях используется для выявления специфических белков и антигенов в крови, ликворе, органах, тканях больных, а также в экспериментальных материалах.

В наиболее распространенном варианте этого теста (анализ на твердой фазе) применяют два препарата антител: первичные антитела, специфические для тестируемого белка и адсорбированные на твердой подложке, с которым смешивают определенное количество анализируемого образца; затем для выявления комплекса «антитело-антиген» добавляют вторичные антитела, специфичные для другого участка тестируемого белка, которые конъюгированы с ферментом. Фермент катализирует изменение окраски специального субстрата, добавляемого в последнюю очередь, что регистрируется фотометрически.

Для определения антигенов и антител разработаны многочисленные варианты иммунологического анализа с помощью меченых реагентов. В

качестве меток могут быть использованы не только ферменты, но и изотопные, хемилюминесцентные и флуоресцентные метки.

Выделяют гомогенные и гетерогенные методы ИФА. Гомогенные — это методы, в которых три стадии анализа проходят в растворе, и между ними нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от не прореагировавших компонентов. Гетерогенные методы проходят в двухфазной системе с участием твердой фазы-носителя, и присутствует обязательная стадия отмывки, то есть разделения иммунных комплексов от не прореагировавших компонентов, которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а не прореагировавшие комплексы — в растворе).

Конкурентный метод. В данном методе используется реакция между антигенами, связанными с твердой фазой и конкурирующими между собой меченными ферментом антителами (конъюгатом) и антителами опытной пробы. Конъюгата связывается тем меньше, чем больше специфических антител в пробе. После удаления несвязавшихся компонентов в ходе промывки измеряют ферментативную активность иммобилизованного комплекса.

Метод с использованием меченого антигена. На твердой фазе иммобилизованы антитела, специфические к определенному классу Ig (либо — к нескольким классам). Исследуемую сыворотку вносят на твердую фазу. Образуется комплекс антиген-антитело. После удаления в ходе промывки несвязавшихся компонентов, вносят избыток конъюгата, которым является меченый антиген. Метод позволяет определить все классы иммуноглобулинов, в том числе и IgЕ.

Метод двойного «сэндвича» для антител. На твердой фазе иммобилизованы антитела, специфические к определенному классу Ig. В результате добавления антигена происходит его связывание со специфическими антителами сыворотки. Затем к твердой фазе добавляют

избыток антител к тому же антигену, меченых ферментом (конъюгат). Антитела в составе такого конъюгата должны быть поликлональными.

Непрямой метод. На твердой фазе иммобилизируют антиген, затем добавляют исследуемую сыворотку. В присутствии сывороточных специфических антител образуется комплекс антиген-антитело. После удаления несвязавшихся белков к твердой фазе добавляют избыток меченых антител, специфических к определенным антителам (антивидовые). После удаления в ходе промывки несвязавшегося конъюгата к твердой фазе добавляют раствор субстрата. При этом ферментативная активность будет пропорциональна количеству специфических антител в исследуемом образце. Данный метод наиболее распространен и используется в большинстве коммерческих тест- систем.

Гомогенный метод определения антител. На твердой фазе иммобилизован антиген. В лунку вносят конъюгат этого же антигена с ферментом и исследуемую сыворотку. Специфические антитела образуют сложный комплекс, они одновременно связываются с антигенами, находящимися как на твердой, так и в жидкой фазах. При связывании антителами конъюгата изменяется активность фермента в исследуемом образце.

Одним из современных методов лабораторной диагностики является хемилюминесцентный иммуноанализ, который используется на анализаторе Иммулайт. Процесс хемилюминесценции включает в себя две стадии: образование продукта в электронном возбужденном состоянии (хемилюминесцентная реакция) и испускание кванта света (люминесценция). Хемилюминесценция — это процесс излучения фотонов (свечение) при переходе электронно-возбужденных продуктов окислительных химических реакций в исходное энергетическое состояние. В таких реакциях выделяется значительное количество энергии, что обеспечивает высокую чувствительность метода.

Иммунохимический метод с определением при помощи электрохемилюминесценции обладает наибольшей чувствительностью и специфичностью. В нем в качестве метки используется комплекс рутения с трипропиламином, который генерирует электрохимический свет при подаче электрического импульса. Именно этот метод применяется в таких анализаторах, как Элексис, Модуляр, Кобас.