Tomchuk_POSІB_VET_BІOHІMІJa

• RM використовують у процесі калібрування вимірювальної системи, для оцінки методики вимірювання, для приписування значень іншим матеріалам, а також при контролі якості.

• У процесі даного конкретного виміру RM можна використовувати тільки з однією метою.

Пункт 4 є дуже важливим, оскільки підкреслює принцип – зразок порівняння, використаний при валідації методики, не можна використовувати знову для рутинного градуювання. Можна використовувати матеріал того ж типу, але від іншого постачальника. Не можна використовувати один і той же матеріал для градуювання і в якості зразка для контролю якості.

Як приклади RM можна навести такі:

•чисті речовини – пестициди з вказаною ступеню чистоти або розчин пестицидів із зазначеними концентраціями (маса/об’єм);

•стандартні розчини: нікель, розчинений в кислоті з вказаною

концентрацією (маса/об’єм );

•розчин гідроксиду натрію з вказаною концентрацією (молярна);

•матричні зразки порівняння – природні матеріали: річкові

опади з зазначеними концентраціями металів; сухе молоко з вказаним вмістом жиру і паста з крабів з вказаними концентраціями слідових елементів;

•матричні RM – матеріали з внесеними добавками: озерна вода з додаванням мікродомішок і сухе молоко з внесеними добавками органічних домішок;

•фізико-хімічні стандарти – бензойна кислота з вказаною точкою плавлення; n-ксилол з вказаною температурою спалаху; пісок

із зазначеним розподілом часток за розмірами і полімери з вказаним розподілом по молекулярній вазі.

Термін «сертифікований зразок порівняння (CRM) визначається як «зразок порівняння, попередня метрологічна достовірна процедура валідації для оцінки однієї або декількох характеристик, яка супроводжується сертифікатом, що підтверджує значення величини відповідної характеристики, зв’язану з нею невизначеність і метрологічну простежуваність».

471

• Метрологічна достовірність процедури виготовлення та сертифікації зразків порівняння викладені, серед іншого, в ISO Guide 34 і ISO Guide 35.

• У ISO Guide 31 представлено настанову із зберігання сертифікатів.

Деякі виробники/постачальники зразків порівняння випускають свою продукцію під різними найменуваннями. Наприклад, стандартні зразки порівняння (SRM) представляють собою сертифіковані зразки порівняння, що випускаються Національним інститутом стандартів і технологій (NIST), а Європейські зразки порівняння (ERM) представляють собою CRM, вироблені за участю трьох європейських виробників стандартних матеріалів, а саме ВАМ (Федеральний інститут дослідження та випробувань матеріалів, Німеччина), IRMM (Європейська комісія. Об’єднаний дослідницький центр, Інститут матеріалів порівняння і вимірів, Бельгія ) і LGC (Великобританія).

Сертифіковані зразки порівняння знаходять наступне застосування:

•забезпечення метрологічної простежуваності результатів;

•підтвердження ідентичності матеріалів;

•градуювання та верифікація процесів вимірювання в рутин-

них умовах;

•перевірка (верифікація) коректності застосування стандартних методів;

•розробка та валідація нових методів вимірювань;

•визначення значень величин для інших матеріалів, які можна використовувати в якості вторинних стандартів (калібрантів);

•внутрішній контроль якості та схеми забезпечення контролю

якості.

Розробка і атестація сертифікованих зразків порівняння – процес дорогий. Через це сертифіковані зразки порівняння використовуються, як правило, при первинній валідації методу. Застосування сертифікованих зразків порівняння для щоденного контролю якості навряд чи виправдано економічно, хоча їх можна використовувати для «калібрування» інших, більш дешевих вторинних

472

матеріалів, за допомогою яких доцільно проводити рутинний контроль якості.

Б. Хімічні стандарти

Термін «хімічні стандарти» застосовують для позначення хімічних речовин (як правило, індивідуальних речовин), для яких надійно визначена чистота.

Хімічні стандарти можна використовувати для калібрування двома різними способами. Можна застосовувати їх як «зовнішні» стандарти – в цьому випадку вимірювання проводять окремо, не вводячи їх до складу проби; або ж в якості стандартів «внутрішніх»

– в цьому випадку стандарт додають у пробу, вимірювання проби і стандарту проводять одночасно, тобто аналізують єдину «збагачену» пробу. Ці два різних підходи часто позначають термінами «зовнішня стандартизація» і «внутрішня стандартизація».

Зовнішня стандартизація

Для зовнішньої стандартизації використовують один або кілька хімічних стандартів відомої концентрації; вимірювання проводять в той же час, що і вимірювання проби, тими ж засобами, якими визначають вміст аналіту в пробах. Чисті хімічні стандарти однієї концентрації можна використовувати для визначення коефіцієнтів чутливості приладів (очікуваної величини, зміни сигналу при зміні концентрації аналіту). При проведенні валідаційних досліджень хімічні стандарти різної концентрації (як правило, щонайменше, сім концентрацій, включаючи холосту пробу) використовують для побудови градуювального графіку. Якщо подібне дослідження показало, що залежність аналітичного сигналу від концентрації є лінійним, то для побудови градуювального графіку можна використовувати меншу кількість концентрацій при застосуванні методу для аналізу проб. Тому коефіцієнт відгуку при вказаній концентрації дорівнює градієнту графіка у зазначеній точці, тобто

чутливості.

Концентрацію аналіту в пробах визначають за градуювальним графіком шляхом знаходження значення концентрації, відповідного значенню виміряного сигналу. Зауважимо, що при використанні

473

градуювальних графіків не можна виходити з припущення про те, що графік проходить через точку (0,0), якщо це не підтверджено вимірюванням відповідної холостою проби. Розрахунок концентрації аналіту в пробі за допомогою градуювального графікуа можна проводити тільки в інтервалі концентрацій, обмеженому максимальною і мінімальною концентрацією хімічного стандарту або величиною сигналу «холостої» проби. Не намагайтеся екстраполювати графік за межу зазначеного інтервалу. Пам’ятайте, що значення концентрацій, що визначаються за допомогою градуювального графіку, будуть більш надійні в середній ділянці графіку і менш надійні в крайніх областях зазначеного діапазону.

Зовнішні хімічні стандарти використовують у багатьох ситуаціях. В ідеальному випадку, матриці хімічних стандартів повинні збігатися з матрицями проб для того, щоб забезпечити впевненість у тому, що прилад в процесі вимірювання хімічного стандарту дає відгук, аналогічний відгуку при вимірюванні проби. В окремих випадках процесам підготовки проби і вимірювання властиві похибки, які можуть привести до втрати аналіту. У подібних ситуаціях хімічні стандарти слід обробити так само, як і проби, щоб втрати в пробах були еквівалентні втрат у стандарті. У деяких випадках велика похибка з’являється в момент введення проби або стандарту у вимірювальний прилад. Наведемо приклад – ручне введення проби малого об’єму в капілярну колонку газового хроматографа. Потрібна неабияка майстерність для того, щоб вводити постійний об’єм в колонку. Нерідко розкид величин об’єму становить 10–50 %. Вплив варіацій на результат можна усунути, змінивши процедуру. Хімічний стандарт А використовують для побудови калібрувального графіка, а другий хімічний стандарт В додають на етапі вимірювання як до розчину хімічного стандарту А, так і до розчину проби. У цьому випадку будують графік залежності відношення сигналу стандарту А до сигналу стандарту В від концентрації. У цьому випадку концентрація аналіту не залежить від розміру проби або техніки введення проби.

474

Внутрішня стандартизація

Внутрішня стандартизація полягає в додаванні хімічної стандарту до розчину проби, щоб забезпечити можливість ефективного одночасного вимірювання стандарту і проби. Внутрішні хімічні стандарти можуть являти собою реальний аналіт; аналіт, позначений ізотопом; або ж близьку за хімічним складом речовину. Останнє зазвичай вибирають з числа речовин, імовірно відсутніх в пробі, яке, як вважають, буде проявляти себе в процесі вимірювань аналогічно аналіту. Існує кілька способів застосування внутрішніх стандартів, а іноді вони служать різній меті.

Як згадувалося в останньому абзаці, при додаванні близької хімічної речовини, як до хімічних стандартів, так і до проб, проблеми з розкидом об’єму введеної проби усуваються. Існує інший варіант використання хімічних стандартів подібного роду, тобто стандартів, які є внутрішніми калібрантами. У процесі вимірювання внутрішній стандарт повинен демонструвати характеристики, аналогічні характеристикам проби, проте сигнали повинні бути помітними. Коли близьку речовину додають на ранньому етапі процесу вимірювання, можна припустити, що всі втрати аналіту в результаті процесу вимірювання в рівній мірі проявляться у впливі на хімічний стандарт і аналіт. Таким чином, поправки до результату на компенсацію, наприклад, неповного вилучення, не буде потрібно. Концентрацію аналіту в пробі визначають за співвідношенням двох сигналів (один сигнал – від стандарту, другий – від проби).

Деякі методи включають процедуру внесення стандартної добавки. Ця процедура полягає в додаванні відомої кількості внутрішнього хімічного стандарту, ідентичного аналіту, до розчину проби. Очевидно, що, якщо внутрішній хімічний стандарт являє собою ту ж речовину, що і аналіт, який визначається то для того, щоб визначити вміст аналіту в пробі, необхідно провести два виміри, а саме: один вимір без додавання хімічного стандарту, другий – з доданням стандарту. Є кілька способів виконання процедури внесення стандартної добавки: тут описані дві з них. Додавання хімічного стандарту, аналогічного аналіту, називають також «spiking» (введення добавки).

475

При виконанні аналізу першим методом – методом стандартних добавок – до проби додають тільки одну порцію стандарту. В цьому випадку вихідна концентрація аналіту А визначається наступним рівнянням:

де Y – концентрація доданого внутрішнього хімічного стандарту;

А – аналітичний сигнал для невідомої концентрації аналіту; В – сумарний сигнал (аналіт невідомої концентрації плюс

доданий хімічний стандарт).

С = (Об’ємстандарту)/(Об’ємпроби+Об’ємстандарту) D = (Об’ємпроби)/(Об’ємпроби+Об’ємстандарту)

Прийнято користуватися внутрішніми хімічними стандартами високих концентрацій, додаючи їх в об’ємах відносно малих порівняно з об’ємом проби. У подібних випадках, там, де об’єм проби набагато більший об’єму доданого хімічного стандарту, D = 1 і С’ визначається рівнянням:

Об’ємстандарту/Об’ємпроби = С’, де

С – коефіцієнт розведення для хімічного стандарту. Рівняння (3.1) спрощується до рівняння (3.2):

Альтернативна процедура внесення стандартних добавок полягає в додаванні декількох порцій відомої кількості хімічного стандарту до розчину проби. Візьміть рівні об’єми розчину проби (рекомендується взяти сім порцій). До всіх цих розчинів, за винятком одного, додайте різні відомі кількості чистого аналіту. Розбавте всі розчини до досягнення однакового об’єму. Виміряйте

476

аналітичний сигнал кожного розбавленого розчину. Побудуйте графік залежності сигналу від концентрації аналіту. Відрізок, що відсікається графіком в негативній області осі X (при = 0) являє концентрацію аналіту в розчині проби. Процедура проілюстрована на рис. 5.4, де продовжена лінія від точки А до точки В прямо вказує концентрацію речовини в пробі, яку шукають. Оскільки графік залежності аналітичного сигналу від концентрації являє собою пряму лінію, шукана концентрація може бути також одержана діленням відрізка, що відсікається графіком на осі ординат, на кут нахилу прямої. З рівняння прямої, представленої на рис. 5.10, у = 69,1 х + 7165, розраховуємо концентрацію аналіту в пробі, вона становить 103,7 мкг/дм3. Щоб мінімізувати невизначеність отриманого значення концентрації, важливо дослідити концентрації у великому інтервалі доданих значень. Внесення стандартних добавок може виявитися корисним підходом у тих випадках, коли неможливе зовнішнє калібрування через те, що на сигнал приладу впливає матриця проби.

Ні методика внутрішньої стандартизації, ні методика зовнішньої стандартизації, не допускають різної поведінки проб і хімічних стандартів через матричні ефекти в пробах або різний стан аналіту в пробах і в хімічних стандартах.

Рис. 5.10. Графік стандартних розведень

477

Хімічний стандарт слід піддавати тій же аналітичній обробці, що й проби, але навіть у цьому випадку слід пам’ятати, що повне вилучення аналіту з матриці проби може виявитися неможливим, якщо аналіт міцно зв’язаний з матрицею. Це необхідно враховувати при розробці аналітичних методів.

Введення добавок розчину шуканого аналіту в пробу також є ефективним способом підтвердження присутності аналіту. При аналізі методом газової або рідинної хроматографії матриця проби нерідко впливає на хроматографічний процес, викликаючи відмінність в часах утримування піків аналіту в пробі і в хімічному стандарті. Таким чином, не можна з упевненістю визначити, чи викликаний при аналізі проби пік, який досліджується присутністю аналіту або ж він відповідає якісь іншій речовині. Шляхом внесення добавок хімічного стандарту в пробу і вимірювання хроматографічним часом утримування збільшеного піку, можна підтвердити ідентифікацію аналіту.

478

5.4. ПРАВИЛА ПРОВЕДЕННЯ КОНТРОЛЮ ЯКОСТІ ТА ОБРОБКА ДАНИХ

5.4.1. Контроль якості

Заходи проводяться залежно від конкретної ситуації. Вони являють собою засіб оцінки поточних робочих характеристик методу, який використовується, а також загальних процедур, які виконуються лабораторією. Існує два види контролю якості, а саме: внутрішній контроль якості та зовнішня оцінка якості.

Перед детальнішим розглядом цих питань слід пояснити, для чого необхідний контроль якості. Як сказано вище, до нього вдаються для того, щоб переконатися в правильності роботи аналітичної системи. Якщо аналогічні вимірювання проводяться багаторазово, то не слід очікувати отримання абсолютно однакових результатів усіх вимірювань. Незначні відхилення результатів природно виникають через невеликі (прийнятних) відмінностей аналітичних систем. Контроль якості використовують для моніторингу відхилень методу (або методики) результатів дослідження, які виникають через непередбачені впливи. Повторний (багатократний) аналіз зразків контролю являє собою найпоширенішу систему моніторингу. Статистична теорія, що лежить в основі системи контролю якості, докладно викладається в контрольних картах.

Дії, які спрямовані на контроль якості, залежать від аналітичної проблеми, яку необхідно вирішити. Заходи формуються в наступному переліку:

•аналіз холостих проб;

•аналіз контрольних проб;

•аналіз повторних проб;

•аналіз «сліпих» проб;

•аналіз хімічних стандартів і добавок.

А. «Холості» проби

«Холоста» проба – це проба, яка максимально близька за складом до аналітичних проб, проте в ній повинен бути відсутній аналіт.

479

«Холості» проби використовують для того, щоб визначити, яку похибку вносить хімічний склад матриці, який безпосередньо не вимірюється.

Наприклад, ви можете розчиняти пробу в нітратній кислоті при підготовці її до аналізу на вміст слідів Купруму і Ніколу методом атомно-абсорбційної спектрометрії. Досить імовірно, що азотна кислота, так само як і проба, містить ті ж метали в слідових кількостях. Тому аналіз «холостої» проби повинен полягати в аналізі нітратної кислоти, яка не містить проби. Всі реактиви, застосовувані в процесі підготовки проби до аналізу, слід перевіряти для того, щоб не було спотворень результатів вимірювань. Аналіз всіх реактивів за відсутності проби називають іноді «холостим» дослідом.

Б. Зразки контролю (ЗК)

При контролі якості зразки контролю (ЗК) являють собою засіб оцінки варіацій результатів аналізу всередині аналітичних серій і між серіями. Зразок контролю являє собою матеріал, характеристики якого повністю вивчені лабораторією, яка проводить аналітичні вимірювання, або ж третьою стороною. Зразок контролю аналогічний за складом типовим аналітичним пробам, є стабільним, гомогенним матеріалом, доступним у великих кількостях, щоб його можна було використовувати протягом тривалого періоду часу для забезпечення достовірності результатів.

Зразки для контролю не обов’язково досліджувати «повністю». Головна вимога – однорідність і стабільність. Зразок для контролю також не обов’язково повинен бути «аналогічний за складом» робочим пробам. Призначення зразка для контролю – демонструвати стан вимірювального процесу, а для цього достатньо того, щоб він поводився у випробуваннях подібно робочим пробам.

В якості зразка контролю (ЗК) можна використовувати зразок порівняння. Стабільність і гомогенність зразка порівняння забезпечує впевненість у тому, що причиною відхилень результатів аналізу є варіації аналітичного методу, а не зміни в складі зразка. Моніто - ринг відхилень результатів аналізу зразка контролю зазвичай здійснюють за допомогою контрольних карт. Подібні контрольні

480