19. Области применения стеклянной и пластиковой посуды. Основные подходы, способы и степень подготовки культуральной посуды к культивированию клеток.

Основная часть ассортимента специальной культуральной посуды предназначена для роста клеток в монослое, что определяет особые требования к свойствам поверхности и материала изделий как из стекла, так и из пластика. Для культивирования клеток обычно используют флаконы, колбы, матрасы, чашки Петри, платы, роллерные сосуды, пробирки, пипетки и т. д.

Хотя в последние годы широко применяется пластиковая посуда одноразового использования, посуда из стекла не утратила своего значения благодаря ряду бесспорных преимуществ: хорошие адгезионные свойства поверхности, способствующие прикреплению клеток; многократность использования; биологическая инертность стекла ряда составов; термостойкость и другие. Кроме того, в экспериментах с контролируемым уровнем кислорода необходимо пользоваться именно стеклянной посудой, т.к. в пластике кислород может растворяться. Помимо этого, из пластика могут экстрагироваться водорастворимые органические соединения.

Для стеклянной лабораторной и культуральной посуды на практике в основном применяются два типа составов – многощелочное и малощелочное боросиликатное стекло типа «Пирекс». Щелочесодержащие силикатные стекла имеют недостаточную термостойкость и химическую устойчивость к воде, кислотам и щелочам. Алюмоборосиликатные малощелочные стекла типа «Пирекс» характеризуются высокой устойчивостью к воде, устойчивостью к щелочным растворам и ко всем кислотам, за исключением плавиковой (фтористоводородной) и горячей фосфорной. Кроме того, стекла типа «Пирекс» обладают хорошими оптическими свойствами.

При работе с культурами клеток пластиковая посуда в отдельных случаях более пригодна из-за характерных особенностей некоторых клеточных линий. Такая посуда проста в использовании, т.к. выпускается в стерильном, готовом к работе виде. Стерилизация производится в процессе изготовления физическими (облучение УФ светом или гамма-лучами) или химическими (газы – окись этилена, жидкости – этиловый спирт, раствор пергидроля) способами. Пластиковая посуда производится в двух модификациях: для культивирования микроорганизмов и для культивирования клеток. Такое разделение вызвано тем, что культивируемые клетки (речь идет о монослойном культивировании) в отличие от бактериальных клеток находятся в непосредственном контакте с поверхностью сосуда, которая является для них субстратом. Клетки оседают на этой поверхности, прикрепляются и распластываются. Для улучшения адгезионных свойств поверхности из полистирола ее подвергают специальной обработке, в то время как биологическая посуда не обрабатывается.

20. Принципы составления питательных сред.

При составлении питательных сред нужно соблюдать некоторые правила.

Среды должны изготовляться в точном соответствии с их рецептурой (качественно-количественном составом). При этом необходимо соблюдать и последовательность внесения компонентов, указанную в инструкции по их изготовлению. Отклонение от этого правила может привести к помутнению среды, образованию осадка.

Последовательное растворение компонентов в дистиллированной или водопроводной воде проводят при нагревании и постоянном перемешивании, осуществляя визуальный контроль над полнотой их растворения. Необходимо следить за тем, чтобы продолжительность нагрева среды была бы минимальной, так как в результате длительного воздействия повышенных температур возможны деструкция и изменение свойств отдельных компонентов.

Особого внимания требует коррекция рН среды на всех стадиях ее изготовления. Коррекцию рН следует вести осторожно с тем, чтобы не допустить существенного подкисления или перещелачивания среды, и таким образом избежать необходимости последующей дополнительной коррекции. Дополнительное внесение кислот и щелочей не только влияет на химические процессы, протекающие в среде, но и увеличивает концентрацию минеральных солей. Кроме того, необходимо учитывать, что в процессе стерилизации сред автоклавированием этот показатель, в зависимости от состава среды, может изменяться в той или иной степени.

Некоторые компоненты среды следует стерилизовать отдельно из-за их чувствительности к нагреванию или к действию рН при повышенной температуре.

В подавляющем большинстве питательные среды должны быть прозрачными. С этой целью их подвергают фильтрованию. Жидкие и содержащие желатин среды (в горячем виде) фильтруют через бумажные фильтры, среды с агаром — через ватно-марлевые. В случаях, когда после фильтрования среды остаются мутными, к среде добавляют вещества-осветители: белок куриного яйца, сыворотку крови лошади или других животных, цельную кровь, химически чистый мел, древесный уголь и др.

В лабораторных условиях изготавливать среды лучше в посуде из нержавеющих материалов или нейтрального стекла. Другие типы стекла могут быть источниками микроэлементов или не выдерживать стерилизацию и др. Для изготовления питательных сред в больших объемах желательно использовать емкости из нержавеющей стали или боросиликатного стекла. Для этих целей абсолютно непригодна медная, оловянная и оцинкованная посуда как источник ионов тяжелых металлов, обладающих ингибиторными свойствами.

Приготовленные среды разливают в чистую и сухую посуду (колбы, флаконы, пробирки, специальные планшеты и др.), которую закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют. Однако в таком виде стерильная среда не может длительно храниться, так как быстро сохнет. Чтобы избежать высыхания, среды разливают в стеклянные флаконы, герметично закрывают их резиновыми пробками, которые затем завальцовывают алюминиевыми колпачками. В таком виде среды могут храниться больше года. Среды, разлитые в чашки Петри, также можно длительно хранить, если чашки со средой запаять в полиэтиленовые пакеты.