3. Методы цитологии: электронная микроскопия, ультрамикротомия, контрастирование объектов, сканирующая электронная микроскопия.

Ответ. В просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ) вместо света применяют пучок электронов. При создаваемой высокой разности потенциалов (ускоряющем напряжении 50−600 кВ) электроны, составляющие пучок, имеют очень малую длину волны, что позволяет получать изображение изучаемого объекта с высоким разрешением. Теоретически разрешение просвечивающего электронного микроскопа составляет 0,002 нм. Реальное разрешение современных микроскопов приближается к 0,1 нм. Для биологических объектов разрешение ПЭМ на практике составляет 2 нм. Электронная томография. Этим методом с помощью серии микрографий, сделанных под разными углами, можно получить суммарную картину трёхмерной структуры исследуемого объекта (например, клеточных органелл). Сканирующий просвечивающий электронный микроскоп. С помощью сканирующего просвечивающего электронного микроскопа изучают структуру поверхности объекта, сканируя её с помощью тонкого электронного луча (диаметром в несколько ангстрем). Микроскоп даёт возможность изучать молекулы при субнанометровом разрешении. Сканирующие зондовые микроскопы позволяют получить изображение исследуемого объекта при его сканировании с помощью микроскопических игл ¾ зондов, имеющих очень острые окончания. Зонды могут быть различными: механическими, электрическими, оптическими, тепловыми и проч. К сканирующим зондовым микроскопам относятся атомносиловой микроскоп, сканирующий туннельный микроскоп, сканирующий ближнепольный оптический микроскоп, сканирующий тепловой микроскоп, сканирующий ионную проводимость микроскоп и др. Атомно–силовая микроскопия позволяет получать трёхмерные изображения профилей поверхностей биологических объектов в нанометровом масштабе. С помощью атомно-силового микроскопа (АСМ) можно исследовать размеры и конформацию как единичных молекул, так и их конгломератов, фиксированных к твёрдым поверхностям. С помощью АСМ можно манипулировать отдельными молекулами (например, перемещать их с места на место). В основе работы АСМ лежит сканирование поверхности изучаемого объекта с помощью тончайшего зонда (иглы). Сканирующие туннельные микроскопы позволяют изучать структуру поверхности образца с разрешающей способностью до отдельных атомов. В основе работы микроскопа лежит использование т.н. туннельного эффекта. В его основе лежит явление прохождения электронов через барьер, образованный разрывом электрической цепи, — очень малым расстоянием (туннельным зазором), создаваемым между остриём зонда и электропроводящей поверхностью исследуемого объекта. Отдельно выделяются лазерная конфокальная микроскопия и рентгеновская микроскопия. Контрастирование (химическое и физическое) - обработка исследуемых образцов для повышения общего контраста изображения и(или) выявления отдельных элементов их структуры.

4. Устройство и принцип работы электронного микроскопа. Разрешающая способность и увеличение электронного микроскопа. Особенности подготовки биологического материала для электронной микроскопии. Фиксаторы и красители.

Ответ. Электронный микроскоп (ЭМ) — прибор, позволяющий получать изображение объектов с максимальным увеличением до 106 раз, благодаря использованию, в отличие от оптического микроскопа, вместо светового потока, пучка электронов с энергиями 200 эВ — 400 кэВ и более (например, просвечивающие электронные микроскопы высокого разрешения с ускоряющим напряжением 1 МВ). В просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ) для формирования изображения используется высокоэнергетический электронный пучок. Электронный пучок создается посредством катода. Полученный электронный пучок ускоряется обычно до 80—200 кэВ (используются различные напряжения от 20 кВ до 1 МВ), фокусируется системой магнитных линз (иногда электростатических линз), проходит через образец так, что часть электронов рассеивается на образце, а часть — нет. Таким образом, прошедший через образец электронный пучок несет информацию о структуре образца. Далее пучок проходит через систему увеличивающих линз и формирует изображение на люминесцентном экране (как правило, из сульфида цинка), фотопластинке или ПЗС-камере. Основными недостатками ПЭМ являются необходимость в очень тонком образце (порядка 100 нм) и неустойчивость (разложение) образцов под пучком. В своих наиболее распространенных конфигурациях, электронные микроскопы дают изображения с отдельным значением яркости на каждый пиксель, с результатами, как правило, изображенными в оттенках серого. Однако, часто эти изображения затем раскрашены посредством использования программного обеспечения, или просто ручным редактированием с помощью графического редактора. Это делается обычно для эстетического эффекта или для уточнения структуры и, как правило, не добавляет информацию об образце. В электронном микроскопе образец облучается не видимым светом, а пучком электронов. Длина же электронной волны значительно меньше, чем световой. Соответственно, такая волна “чувствует” меньшие препятствия: разрешающая способность микроскопа оказывается выше. Конструктивная же особенность состоит в том, что в электронном микроскопе в качестве линз используются электромагнитные катушки. Ход лучей в электронном микроскопе, в принципе, таков же, как в световом - источником электронов служит катод, а движущей силой - разность потенциалов между катодом и анодом. Анод расположен вблизи катода и имеет отверстие посередине, через которое проскакивают электроны. Чтобы их поток далее не ослабевал, в тубусе микроскопа создаётся высокий вакуум. Одна электромагнитная катушка служит в качестве конденсора (фокусирует пучки на образце), вторая катушка - в качестве объектива (принимает лучи, расходящиеся от образца), а третья катушка - в качестве окуляра, или проекционной линзы. Лучи, проходящие через последнюю катушку, попадают далее на люминесцентный экран и вызывают его свечение в месте падения электронов. Разрешающая способность (разрешение) - наименьшее расстояние между двумя элементами микроструктуры, видимыми на изображении раздельно. Длина волны де Бройля электронов, ускоренных в электрическом поле с разностью потенциалов 1000 В, равна 0,4 Å, что много меньше длины волны видимого света. Вследствие этого, разрешающая способность электронного микроскопа в более чем 10000 раз может превосходить разрешение традиционного оптического микроскопа. А́нгстрем (русское обозначение: Å; международное: Å) — внесистемная единица измерения длины, равная 10⁻¹⁰ м (1 Å = 0,1 нм = 100 пм; 10 000 Å = 1 мкм). Особенности приготовления препарата. Материал берут очень маленькими кусочками (порядка 1 мм 3), а фиксацию осуществляют обычно в 2 стадии: вначале глутаральдегидом (стабилизация белков), затем - четырёхокисью осмия (стабилизация фосфолипидов и контрастирование ткани). Уплотнение материала. Образцы, как обычно, обезвоживают, а для их дальнейшего уплотнения используют эпоксидные смолы. Заливку производят в специальных формах, затвердевание смеси происходит путём её полимеризации в термостате, и затвердевшие блоки имеют вид маленьких свечей. Срез делают с помощью ультратома; их толщина - 30-50 нм (ср. с микротомными срезами - 10.000 – 20.000 нм). Затем их переносят на сеточки (играющие роль предметного стекла). Окрашивание срезов сводится к их контрастированию с помощью солей тяжёлых металлов (свинца, вольфрама, урана). Эти соли осаждаются на фосфолипидах мембран и поглощают электроны. Поэтому соответствующие места клетки выглядят более тёмными.