ЗАНЯТИЕ 16

ТЕМА ЗАНЯТИЯ: «РЕАКЦИИ ИММУНИТЕТА (ОКОНЧАНИЕ)»

1. Р-ция иммунного гемолиза: необходимые ингредиенты, методика постановки, контроли, практическое применение. Р-ция связывания комплемента (РСК): принцип РСК; что образуется при взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном; что происходит с комплементом, если он присутствует при этом взаимодействии?

Р-ция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комплексом антиген—антитело. Если же комплекс антиген—антитело не образуется, то комплемент остается свободным.

Специфическое взаимодействие АГ и AT сопровождается адсорбцией (связыванием) комплемента. Поскольку процесс связывания комплемента не проявляется визуально, Ж. Борде и О. Жангу предложили исполь. в кач-ве индикатора гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка), которая показывает, фиксирован ли комплемент комплексом АГ-АТ. Если АГ и AT соответствуют друг другу, т. е. образовался иммунный комплекс, то комплемент связывается этим комплексом и гемолиза не происходит. Если AT не соответствует АГ, то комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со 2ой системой и вызывает гемолиз.

Протекание реакции Реакция протекает в 2 фазы с участием 2х систем; бактериальной и гемолитической. В 1ой реакции (специфическая) участвуют антиген 4-+ антитело + комплемент. Положительный результат реакции, наступающий при соответствии антител антигену, характеризуется образованием специфического бактериального комплекса антиген — антитело с адсорбированным, или «связанным», комплементом. Оставаясь невидимым, комплекс не вызывает никаких внешних изменений той среды, в которой он образовался. Отрицательный результат РСК имеет место при отсутствии специфического сродства между антигеном и антителом сыворотки и характеризуется сохранением свободного активного комплемента. 1ая фаза РСК может проводиться в термостате при 37°С (1—2 ч) или в холодильнике при 3—4°С (18—20 ч).

При длительном образовании иммунного комплекса антиген-антитело на холоду происходит более полное связывание комплемента и вследствие этого чувствительность реакции увеличивается. При постановке сравнительных опытов советским иммунологом акад. В. И. Иоффе и его учениками было показано, что в условиях длительного связывания комплемента на холоду можно уловить в 100—500 раз меньшие количества антигена и получить положительные результаты при больших разведениях иммунной сыворотки, чем в опыте связывания комплемента при температуре 37 °С в течение 1—2 ч. 2ая фаза реакции (индикаторная) происходит между реагентами гемолитической системы (смесь 3% взвеси эритроцитов и гемолитической сыворотки в равных объемах) при температуре 37 °С только при наличии комплемента, оставшегося свободным от 1ой фазы реакции (реакция отрицательная). При отсутствии свободного активного комплемента гемолиза эритроцитов под действием специфических гемолизинов не наступает (реакция положительная).

Компоненты Реакция связывания комплемента (РСК) относится к сложным серологическим реакциям. Для ее проведения необходимы 5 ингредиентов, а именно: АГ, AT и комплемент (1ая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (2ая система).

Антигеном для РСК мб культуры различных убитых микроорганизмов, их лизаты, компоненты бактерий, патологически измененных и нормальных органов, тканевых липидов, вирусы и вирусосодержащие материалы.

В качестве комплемента используют свежую или сухую сыворотку морской свинки.

Механизм реакции РСК проводят в 2 фазы: 1-я фаза — инкубация смеси, содержащей 3 компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген—антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит — антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз; реакция отрицательная.

Применение Реакцию связывания комплемента можно применять для: 1) выявления специфических антител в неизвестной сыворотке на основании взаимодействия их с антигеном известной природы;

2) изучения свойств антигена в реакции с известной специфической сывороткой. Подготовка ингредиентов для постановки РСК.

1. Сыворотку крови, полученную для исследования, накануне постановки реакции прогревают в водяной бане при 56°С в течение 30 мин для инактивации ее собственного комплемента. Инактивированная сыворотка может храниться при температуре 3—4°С в течение 5—6 дней. В день постановки-опыта сыворотку разводят изотоническим раствором хлорида натрия в соотношении 1:5 (0,1 мл исследуемой сыворотки,+ 0,4 мл изотонического раствора хлорида натрия).

2. Антигеном для постановки РСК мб культуры разнообразных микробов, бактериальные белки и экстракты, полученные из микробных культур, патологически измененных и нормальных органов и тканей. Особенности приготовления антигена определяются характером инфекционного процесса и особенностями его возбудителя.

3. Комплементом является смесь сывороток, полученная от 3—5 здоровых морских свинок, или сухой комплемент в ампулах.

Непосредственно перед употреблением сыворотку морской свинки разводят изотоническим раствором хлорида натрия в отношении 1 : 10, получая основной р-р.

4. Гемолитическую сыворотку перед постановкой опыта инактивируют прогреванием при температуре 56 °С в течение 30 мин. Для постановки основного опыта РСК, а также для титрования комплемента и антигена применяют гемолитическую сыворотку в тройном титре. Например, если титр гемолитической сыворотки 1: 1800, в реакции применяют разведение сыворотки 1 : 600.

2. Какова судьба комплемента в том случае, если между антигеном и антителами нет специфического сродства? С помощью какой реакции можно определить, что произошло с комплементом; почему используется именно эта реакция?

Если антитело не соответствует антигену, комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со 2ой системой (1ая система – специфическая; 2ая система – индикаторная (гемолитическая), вызывая гемолиз – реакция отрицательная.

Оставшийся свободным, комплемент участвует во 2ой системе, вызывая гемолиз, - результат РСК отрицательный (содержимое пробирок прозрачно - "лаковая кровь").

Об образовании этого комплекса узнают с помощью 2ой системы гемолитической или индикаторной. В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело), т.е. готовый иммунный комплекс. В этой системе лизис эритроцитов может произойти только в присутствии комплемента. Если комплемент связан 1ой системой (при соответствии в ней антигена и антитела), то во 2ой системе гемолиза не будет - тк нет свободного комплемента. Отсутствие гемолиза (содержимое пробирки мутное или на дне ее Осадок эритроцитов) регистрируют как положительный результат РСК.

3. Если конечным результатом рск является гемолиз, что это означает - положительный или отрицательный результат? Методика постановки.

Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), те происходит связывание комплемента комплексом антиген - антитело. Если же комплекс антиген - антитело не образуется, то комплемент остается свободным. PCK проводят в 2 фазы 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент, 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической

Схема РСК с сывороткой больного
Схема РСК с сывороткой здорового

сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген - антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная). Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная).

4. Почему исследуемую сыворотку надо инактивировать? Для чего необходимо определение титра и рабочей дозы комплемента?

Сыворотку крови инактивируют в суховоздушном инактиваторе или водяной бане в течение 30 мин при 56° для уничтожения естественного комплемента и стабилизации глобулиновых фракций испытуемой сыворотки крови. Инактивированные сыворотки крови могут храниться в холодил. в течение 5-6 дней.

Рабочая доза комплемента – это количество комплемента, увеличенное против титра на 25-30%. Это необходимо потому, что активность комплемента мб несколько подавлена др. ингредиентами.

Гемолитическая сыворотка титруется, для постановки р-ции испол. сыворотку, усиленную против титра в 3-4 р. Напр, если титр сыворотки 1:1800, то в р-ции применяют разведение 1:600.

5. Что произойдёт, если в реакции будет избыток комплемента или недостаточное количество его? Гемолитическая сыворотка: что содержит, как её получают, что такое титр и как его определяют?

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА — иммунологическая реакция определения антител по известному антигену или антигенов по известному антителу, основанная на способности антител, входящих в состав иммунных комплексов, связывать комплемент.

РСК — 2хфазная реакция. В 1ой фазе р-ции искомый антиген (или антитело) смешивают с диагностической сывороткой крови (или антигеном-диагностикумом) в присутствии комплемента и смесь выдерживают некоторое время для завершения реакции. Во 2ой (индикаторной) фазе р-ции смесь инкубируют с гемолитической с-мой, состоящей из эритроцитов барана, сенсибилизированных антиэритроцитарной (гемолитической) сывороткой. Если в 1ой фазе р-ции образуется иммунный комплекс, т. е. искомые антиген или антитело присутствуют в смеси, то происходит связывание комплемента и прибавленные к смеси во 2ой фазе р-ции сенсибилизированные эритроциты не лизируются. Если иммунный комплекс не образовался, то оставшийся свободным комплемент обусловливает лизис сенсибилизированных эритроцитов. Т. о., гемолиз во 2ой фазе р-ции свидетельствует об отсутствии искомых антигена или антитела.

В области большого избытка антител обнаружена прямая зависимость между кол-вом связанного с-мой комплемента и кол-вом участвующего в р-ции антигена, что было использовано рядом исследователей для кол-венного определения некоторых антигенов в РСК.

Для получения гемолитической сыворотки кроликам внутривенно вводят 3-4 раза 50%-ную взвесь бараньих эритроцитов по 2–5 млн. с интервалами в 2-3 дня. На 6-7 день после окончания иммунизации проверяют титр сыворотки. Если он не ниже 1 : 1200, у животного берут кровь из сердца или из краевой вены уха. После инактивации на водяной бане при 55° С в течение 30 мин сыворотку консервируют с добавлением к ней 1 % сухой борной кислоты. Для консервирования сыворотки можно применять равный объем стерильного глицерина, прогретого при 180° С в течение 15 мин или добавлять 1 мл смеси на 9 мл сыворотки такого состава – карболовой кислоты 5,5 мл + глицерина 20 мл +74,5 мл дистиллированной воды. Можно использовать также 0,05%-ный хинозол. Сыворотку надо хранить в запаянных пробирках на леднике.

Гемолитические сыворотки получают путем иммунизации кроликов взвесью эритроцитов барана. Гемолитические сыворотки используют для титрования комплемента и при постановке реакции связывания комплемента в индикаторной системе.

Титром сыворотки называют то ее максимальное разведение, которое в присутствии комплемента вызывает гемолиз 3% взвеси эритроцитов барана.

Титр гемолитической сыворотки определяется по следующей схеме В ряд пробирок последовательно отмеряют по 0,5 мл полученных разведений, начиная с 1 : 1000. Затем в каждую пробирку добавляют по 0,5 мл 3%-ной взвеси эритроцитов, 0,5 мл разведенного 1 : 10 комплемента и 1 мл физиологического раствора. Отмеривать разведения сыворотки надо градуированной пипеткой, начиная с последней пробирки, содержащей минимальное разведение сыворотки, чтобы не нарушить точности разведений.

6. Комплемент: химическая природа, отношение к высокой температуре, где содержится? Как можно разрушить комплемент? Что практически применяется в качестве комплемента? Каким способом обрабатывают комплемент для получения препарата с длительным сроком хранения?

Комплемент- это сис-ма белков крови, кот способны связываться с комплексом антиген-антитело и разрушать антиген (микробную кл). Разрушение микроб кл – лизис. Если в орг отсутствуют микробы-антигены, то комплемент находится в неактивном (разрозненном) состоянии.

Состав: 1. 10 белков, составляющих собственно комплемент и обозначаемых поэто­му буквой С: С1...С9, причем С1-компонент состоит из 3х белковых субъединиц (С1q, С1г, С1s), все остальные представляют собой единичные белковые молекулы. В составе молекулы имеется рецептор для связывания с Рс-фрагментом молеку­лы антитела. Антитела, относящиеся к иммуноглобулинам различных классов, взаимодействуют с комплементами с различной степенью активности. Белки С5, С6, С7, С8 и С9 участвуют в организации мембрано-атакующего комплекса.

2. Регуляторные белки: С1Е1, С4bр, фактор Н, фактор I (инактиватор СЗb/С4b), белок S.

3. Факторы, участвующие в альтернативном пути активации сис-мы комплемента: фактор В (протеиназа), фактор В (гликопротеин), фактор Р (пропердин) — у-глобулин, его обнаружил в 1954 г. Л. Пиллемер. Этот белок, образуя комплекс с эндоток­сином, в присутствии ионов Mg разрушает С3, поэтому был назван пропердином. Пропердин стабилизирует СЗ-конвертазу альтернативного пути.

Ф=ции комплемента многообразны: а) участвует в лизисе микробных и др кл (цитотоксическое действие); б) обладает хемотаксической активностью; в) принимает учас­тие в анафилаксии; г) участвует в фагоцитозе. След, комплемент явл компонен­том многих иммунологических р-ий, направ­ленных на освобождение организма от микробов и др чужеродных кл и антигенов (на­пр, опухолевых кл, трансплантата).

Механизм активации комплемента представляет собой каскад фер­ментативных протеолитических р-ций, в результате кот. образуется активный цитолитический комплекс, разрушающий стен­ку бактерии и др кл. Известны 3 пути активации комплемента: классический, альтернативный и лектиновый.

По классическому пути комплемент активирует­ся комплексом антиген-антитело. Для этого достаточно участия в связывании антигена 1ой молекулы IgM или 2х молекул IgG. Процесс начинается с присоединения к ком­плексу АГ+АТ компонента С1, который рас­падается на субъединицы Clq, Clr и Сls. Далее в реакции участвуют последовательно активированные «ранние» компоненты комплемента в такой последовательности: С4, С2, СЗ. Эта р-ция имеет характер усиливающе­гося каскада, т. е. когда 1 молекула пре­дыдущего компонента активирует несколько молекул последующего. «Ранний» компонент комплемента С3 активирует компонент С5, который обладает св-вом прикрепляться к мембране кл. На компоненте С5 путем последовательного присоединения «поздних» компонентов С6, С7, С8, С9 образуется литический или мембраноатакующий комплекс кот нарушает целостность мембраны (образует в ней отверстие), и кл погибает в результате осмотического лизиса.

Альтернативный путь активации комплемен­та проходит без участия антител. Этот путь характерен для защиты от грамотрицательных микробов. Каскадная цепная р-ция при аль­тернативном пути начинается с взаимодействия антигена (напр, полисахарида) с протеи­нами В, D и пропердином (Р) с последующей активацией компонента СЗ. Далее р-ция идет так же, как и при классическом пути — образу­ется мембраноатакующий комплекс.

Лектиновыи путь активации комплемента также происходит без участия антител. Он ини­циируется особым маннозосвязывающим белком сыворотки крови, кот. после взаимодейс­твия с остатками маннозы на поверхности мик­робных кл катализирует С4. Дальнейший каскад р-ций сходен с классическим путем.

В процессе активации комплемента обра­зуются продукты протеолиза его компонен­тов — субъединицы СЗа и СЗb, С5а и С5b и др, кот обладают высокой биологической активностью. Напр, СЗа и С5а принимают участие в анафилактических р-циях, явл хемоаттрактантами, СЗb — играет роль в опсонизации объектов фагоцитоза. Сложная каскадная р=ция комплемента происходит с участием ионов Са²⁺ и Mg²

 Для получения 1ой серии комплемента делается смесь сыворотки от 30-50 свинок. Обработка крови для получения сыворотки производится обычным, описанным выше способом. Консервантом в жидком комплементе явл смесь из 4,5 % раствора борной кис-ты и сернокислого натрия. Сила комплемента опред. его титром, т.е. наим. дозой, способствующей полному гемолизу 1 мл сенсибилизированных бараньих эритроцитов. Для постановки р-ций иммунитета (гемолиз, бактериолиз, РСК) берут рабочую дозу комплемента, которая на 20-30 % превышает вытитрованную минимальную дозу, тк в р-циях активность комплемента может оказаться несколько подавленной др ингредиентами (антигеном, сывороткой). Комплемент пригоден к отпуску при титре от ОД до 0,25 в разведении 1:10. Он дб прозрачным, негемолизированным, обладать способностью адсорбироваться комплексом антиген + антитело и не быть гемотоксичным. Комплемент выпускается в жидком виде со сроком годности в 2 месяца при условии хранения при температуре 3-6 °С и в высушенном состоянии со сроком годности в 3-4 года. Препарат сухого комплемента сохраняется при обычной комнатной температуре.

7. При постановке каких реакций иммунитета (из перечисленных) необходимо добавлять комплемент: реакция нейтрализации токсина антитоксином, реакция преципитации, реакция агглютинации, реакция иммунного бактериолиза, реакция иммунного гемолиза, РСК?

Реакция связывания комплемента(РСК), реакция иммунного бактериолиза, реакция иммунного гемолиза

8. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ): принцип реакции; укажите последовательность процессов при прямой реакции Кунса; необходимые ингредиенты; что является антигеном, что - антителами, чем помечены антитела; как учитывается результат реакции, c помощью какого микроскопа; как выглядит положительный результат; практическое применение - что можно обнаружить с помощью этой реакции?

Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции, реакция Кунса) - метод выявления специфических АГ с помощью АТ, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения АТ и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток.

Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфекционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности.

Различают 3 разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета. Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

Механизм. На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген — антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связавшихся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими антителами образуются светящиеся комплексы антиген — антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.