1. Как происходит процесс биологического окисления у микробов? Какие различия между аэробным и анаэробным типом биологического окисления (основные этапы, ферменты, участие свободного кислорода, конечный акцептор водорода, продукты окисления).
Процесс биологического окисления дает энергию, необходимую для жизни клетки. Сущность процесса заключается в последовательном окислении субстратов с постепенным освобождением энергии. Энергия запасается в молекулах АТФ.
Окислению подвергаются углеводы, спирты, органические кислоты, жиры и другие вещества. Но для большинства микроорганизмов источником энергии служат гексозы, (глюкоза)
У микроорганизмов существует два типа биологического окисления: аэробный и анаэробный. При аэробном типе участвует кислород, и этот процесс называется дыханием. При анаэробном типе биологического окисления освобождение энергии из органических молекул происходит без участия кислорода и называется брожением.
Начальный этап анаэробного расщепления глюкозы с образованием пировиноградной кислоты (ПВК) происходит одинаково. Эта кислота является тем центральным пунктом, от которого расходятся пути дыхания и многих видов брожений.
При аэробном типе дыхания пировиноградная кислота вступает в цикл трикарбоновых кислот. Водород ПВК поступает в дыхательную цепь. Это цепь окислительных ферментов (цитохромы и цитохромоксидаза). По цепи цитохромов передается водород и присоединяется к активированному под действием цитохромоксидазы кислороду с образованием воды. Конечные продукты аэробного окисления глюкозы - диоксид углерода (углекислота) и вода. В процессе дыхания на одну молекулу глюкозы образуется 38 молекул АТФ.
При анаэробном типе биологического окисления энергия образуется в результате брожений. При спиртовом брожении ПВК превращается в конечном итоге в спирт и углекислоту. Конечным продуктом молочнокислого брожения является молочная кислота, маслянокислого брожения - масляная кислота. При процессах брожения на одну молекулу глюкозы образуется только 2 молекулы АТФ.
2. Что такое брожение, виды брожения. На какие группы можно разделить микробы по способу биологического окисления? Перечислите виды бактерий-анаэробов.
Брожение – метаболический процесс, присущий бактериям, характеризующий энергетическую сторону способа существования нескольких групп прокариот, при котором они осуществляют в анаэробных условиях окислительно-восстановительные превращения органических соединений, сопровождающиеся выходом энергии, которую эти организмы используют.
Спиртовое брожение углеводов вызывают дрожжи (Saccharomyces cerevisiae), некоторые виды бактерий (Sarcina ventriculi) и отдельные представители мукоровых грибов рода Mucor. При спиртовом брожении молекула гексозы распадается на этанол и углекислый газ. В ходе брожения образуется много промежуточных продуктов — гексозомонофосфат, фруктозодифосфат, фосфотриозы, фосфоглицериновая кислота, фосфопировиноградная кислота, пировиноградная кислота, уксусный альдегид и этиловый спирт.
При содержании в сбраживаемом растворе более чем 30% сахара часть его остается неиспользованной, так как при этих условиях образуется до 15% спирта, а при такой концентрации спирт подавляет жизнедеятельность дрожжей.
Уксуснокислое брожение — биологический окислительный процесс, при котором с помощью уксуснокислых бактерий спирт окисляется в уксусную кислоту. Если какую-либо жидкость, содержащую небольшое количество спирта (вино, пиво), оставить открытой, то в ней постепенно появляется уксусная кислота и кожистая пленка (уксусная матка) на поверхности. Уксуснокислые бактерии объединены в род Acetobacter, содержащий ряд видов и подвидов. Этиловый спирт под влиянием уксуснокислых бактерий подвергается окислению, в результате которого вначале образуется уксусный альдегид, а затем — уксусная кислота. При использовании специальных рас уксуснокислых бактерий максимальный выход уксуса достигает 14,5%. Уксуснокислые бактерии превращают ряд многоатомных спиртов в сахар. Одна из таких реакций используется для получения сорбозы из сорбитола.
Молочнокислое брожение — широко распространенное биохимическое явление, давно известное на примере скисания молока. Под влиянием молочнокислых бактерий (семейство Lactobacillaceae)лактоза расщепляется на составляющие ее гексозы — глюкозу и галактозу, которые затем специфическими ферментами превращаются в молочную кислоту. Свертывание молока происходит вследствие того, что молочная кислота отщепляет кальций от казеина, белок превращается в параказеин и выпадает в осадок. Молочнокислые бактерии широко распространены в природе. Они обнаруживаются в молоке, воздухе, на коже, шерсти, в тонком и толстом кишечнике и представлены большим количеством видов палочковидных и кокковидных бактерий, различающихся не только по морфологии, но и физиологическим свойствам (по использованию различных источников углерода и азота).
Маслянокислое брожение также широко встречается в природе. Возбудитель маслянокислого брожения был открыт Л. Пастером. На примере маслянокислого брожения Л. Пастер разработал учение об анаэробах. Типичный представитель бактерий маслянокислого брожения — азотфиксирующий Clostridium pasteurianum. Маслянокислые бактерии в больших количествах встречаются в почве, навозе, на растениях, в молоке, сыре. Маслянокислое брожение — сложный биохимический процесс расщепления углеводов, в ряде случаев жиров и белков, на масляную кислоту, углекислоту и воду, при этом образуется много побочных продуктов — уксусная, молочная, пропионовая и другие кислоты.
Из числа других форм брожения чрезвычайно важным является брожение целлюлозы (клетчатки), в которой заложены огромные запасы углерода. Разложение целлюлозы, которая в количественном отношении представляет один из основных компонентов растительных тканей, осуществляется главным образом высокоспециализированными в отношении питания аэробными и анаэробными микроорганизмами. Среди аэробных бактерий, расщепляющих целлюлозу, наиболее важны скользящие бактерии рода Cytjphaga. Целлюлоза — единственное вещество, которое они могут использовать в качестве источника углерода. Цитофаги быстро растворяют и окисляют целлюлозу.
По типу биологического окисления все микроорганизмы разделяются на облигатные аэробы, облигатные анаэробы, факультативные анаэробы и микроаэрофилы (нуждающиеся в малых количествах кислорода).
Существует два вида данных бактерий: Факультативные, которые способны жить, развиваться и размножаться и в кислородной, и безкислородной среде. К таким микроорганизмам относят стафилококки, кишечную палочку, стрептококки, шигеллы;
Облигатные живут только в среде, где нет кислорода. Если этот элемент появляется в окружающей среде, то происходит гибель облигатных анаэробов.
В свою очередь облигатные анаэробы делятся на две группы: Клостридии – это бактерии, которые образуют споры; возбуждают развитие инфекций – бутулизма, раневых, столбняка.
Неклостридиальные – бактерии, которые не способны образовывать споры. Живут в микрофлоре людей и животных, не опасны для живых существ. К таким бактериям относятся эубактерии, пейллонеллы, пептококки, бактериоды
3. Что такое окислительно - восстановительный потенциал среды, какие микробы лучше растут при низких его значениях, какие - при более высоких? Что такое аэрация питательной среды, как она осуществляется?
О
кислительно-восстановительный
потенциал (Eh), также редокс-потенциал,
характеризует степень активности
электронов в окислительно-восстановительных
реакциях, т.е. реакциях, связанных с
присоединением или передачей электронов.
Обычно в средах за увеличение Eh ответственен кислород; при высоких положительных значениях Eh, обусловленных присутствием растворенного кислорода, подавляется рост всех анаэробных бактерий. В то же время положительные значения Eh, обусловленные присутствием в среде других веществ, могут не препятствовать росту даже строгих анаэробов. Устойчивость к Eh разных анаэробных бактерий различна. Для выращивания строгих анаэробов важно создание более восстановленных условий, чем те, которые обеспечиваются простым удалением кислорода из культуральной среды. Для одних микроорганизмов нужен высокий потенциал, для других - низкий. Анаэробы размножаются при RH2 не выше 5, а аэробы - при RH2 не ниже 10.
По отношению к окислительно-восстановительным условиям среды микроорганизмы разделяют на четыре основные группы: облигатные аэробы, облигатные и факультативные - анаэробы и микроаэрофилы. Облигатные анаэробы развиваются при низком значении Еh (0-14), факультативные анаэробы при Еh (0-30), аэробные микроорганизмы Еh (11-35), микроаэрофилы- Еh (10-20).
Аэрация — искусственное обогащение питательной среды стерильным воздухом или кислородом с целью увеличения выхода биомассы при культивировании (прежде глубинном) аэробных микроорганизмов в жидкой питательной среде.
Простой способ аэрации — встряхивание питательной среды на специальных электрических качелях (реже в барабанах, вращающихся или шюттель-аппаратах).
Более эффективное, особенно в промышленных условиях, пропускания стерильного воздуха под давлением в 0,2-0,5 атм. через толщу питательной среды (так называемое барботирования) с помощью специального прибора — аэратора или насоса. Воздух предварительно стерилизуют пропусканием через фильтр с неадсорбующей ваты или другого материала.
4. Методы культивирования анаэробов. Среда Китта-Тароцци: на чём основано её действие, что входит в её состав, что делают со средой перед посевом и для чего?
Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, создать условия анаэробиоза, т. е. пониженного содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве. Это достигается применением физических, химических и биологических методов.
Физические методы. Основаны на выращивании микроорганизмов в безвоздушной среде, что достигается:
1) посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества;
2) посевом микроорганизмов в глубину плотных питательных сред;
3) механическим удалением воздуха из сосудов, в которых выращиваются анаэробные микроорганизмы;
4) заменой воздуха в сосудах каким-либо индифферентным газом.
Химические методы. Основаны на поглощении кислорода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэростате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия Na2S204.
Биологические методы. Основаны на совместном выращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шириной около 1 см. Получается два агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засевают аэроб, (часто используют S. aureus или Serratia marcescens.) На другую сторону засевают анаэроб. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размножаться аэробы. После того, как весь кислород в пространстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3-4 сут). В целях сокращения воздушного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.
Комбинированные методы. Основаны на сочетании физических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.
Среда Китта-Тароцци - жидкая питательная среда для культивирования анаэробных микроорганизмов, состоящая из мясопептонного бульона, обогащенного экстрактивными продуктами печени животных и содержащего кусочки вываренной печени в качестве поглотителя свободного кислорода.
Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующими веществами является среда Китта-Тароцци, которая используется с успехом для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэробов.
Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в течение 10-15 минут для удаления воздуха. После посева среду заливают небольшим слоем вазелинового масла, чтобы предохранить посев от проникновения воздуха. Выросшие анаэробы вызывают помутнения питательной среды и образование пузырьков газа.