Тема 2. Виды микроскопии. Структура бактериальной клетки.

1.Принципы классификации микроорганизмов.

Классифицировать обитателей микромира можно по разным признакам. В основу классификации микробов пожжены морфологические, физиологические, биохимические и молекулярно-биологические свойства.

I. По наличию клеточной структуры.

1.Микробы – все живые формы микромира клеточные и доклеточные (включая вирусы, прионы, вироиды)

2.Микроорганизмы – микробы, имеющие клеточное строение (это только бактерии (например: кишечная палочка), грибы (например: кандида), простейшие (например: дизентерийная амеба))

II. По патогенности (способности вызывать инфекционные заболевания)

1.Патогенные – микробы, вызывающие инфекционное заболевание

2.Непатогенные – микробы, не вызывающие инфекционное заболевание

3.Условно-патогенные – микробы, которые могут вызвать инфекционное заболевание при определенных условиях.

2.Укажите основные признаки, по которым эукариоты отличаются от прокариот.

Эукариоты представляют собой надцарство живых организмов. В переводе с греческого языка «эукариот» обозначает «владеющий ядром». Соответственно эти организмы в своем составе имеют ядро, в котором закодирована вся генетическая информация. К ним относятся грибы, растения и животные.

Прокариоты – это живые организмы, в клетках которых ядро отсутствует. Характерными представителями прокариот являются бактерии и цианобактерии.

3.Укажите группы микроорганизмов, которые относятся к прокариотам, эукариотам; назовите неклеточные формы.

Прокариоты:

Все прокариоты, имеющие единый тип организации клеток, объединены в один отдел

— Bacteria. Однако отдельные их группы отличаются структурными и физиологическими особенностями. На этом основании выделяют:

1)собственно бактерии;

2)археи;

3)сине-зелёные водоросли (цианобактерии)

4)хлороксибактерии (зелёные водорослеподобные организмы)

5)актиномицеты (актинобактерии);

6)миксобактерии (многоклеточные организмы)

7)спирохеты;

8)риккетсии;

9)хламидии;

10)микоплазмы.

Эукариоты: относятся все широко известные организмы – водоросли, простейшие, плесени, дрожжи, высшие грибы, животные и растения.

Неклеточные формы:

1)Вирусы (от лат. virus - яд) - мельчайшие простейшие формы жизни, не способные жить и размножаться вне животной, растительной или иной клетки. Их геном представлен либо ДНК, либо РНК; у них отсутствуют собственные системы биосинтеза белка и мобилизации энергии. В состав вирусов, кроме нуклеиновых кислот, входят белки, ферменты.

2)Прионы - «инфекционные» белковые частицы, лишенные генетического материала (нуклеиновой кислоты). Вирусы и прионы являются облигатными (обязательными) внутриклеточными паразитами.

4.Перечислите основные структурные элементы бактериальной клетки: постоянные и непостоянные. Какие из структурных элементов зависят от условий существования бактерий?

1)Постоянные: клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана с ее производными, цитоплазма с рибосомами и различными включениями, нуклеоид.

2)Непостоянные: капсула, слизистый чехол, жгутики, ворсинки, эндоспоры, образующиеся лишь на определенных этапах жизненного цикла бактерий.

Споры образуются при неблагоприятных условиях существования бактерий (высушивание, дефицит питательных веществ и др.. Внутри бактериальной клетки образуется одна спора (эндоспора).

5. Клеточная стенка, её биологическая роль, строение.

Клеточная стенка — это плотный полупроницаемый защитный слой, находящийся над клеточной мембраной, характерный для клеток растений, грибов, бактерий и архебактерий.

Функции клеточной стенки:

-защита бактерий от осмотического шока и других повреждающих факторов;

-определение формы бактерий;

-участие в метаболизме бактерий.

Клеточная стенка пронизана порами, через которые происходит транспорт экзотоксинов бактерий. Толщина клеточной стенки составляет 10–100 нм. Основной компонент клеточной стенки бактерий - пептидогликан или муреин, состоящий из чередующихся остатков N-ацетил-N-глюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных гликозидными связями.

Клеточная стенка, формирующаяся во время деления клеток и их роста путем растяжения, называется первичной. После прекращения роста клетки на первичную клеточную стенку изнутри откладываются новые слои, и образуется прочная вторичная клеточная оболочка.

6.Каковы особенности клеточной стенки грамотрицательных и грамположительных бактерий, какое значение имеют эти различия?

7.С помощью каких веществ можно разрушить клеточную стенку? Как называются бактерии, лишённые клеточной стенки - полностью, частично?

8.Цитоплазматическая мембрана: где располагается, биологическая роль, в каких процессах участвует?

Цитоплазматическая мембрана (плазмалемма) — основная, универсальная для всех клеток часть поверхностного аппарата. Ее толщина составляет около 10 нм. Плазмалемма ограничивает цитоплазму и защищает ее от внешних воздействий, принимает участие в процессах обмена веществ между клеткой и внеклеточной средой.

Основными компонентами мембраны являются липиды и белки. Липиды составляют около 40 % массы мембран. Среди них преобладают фосфолипиды.

Молекулы фосфолипидов располагаются в виде двойного слоя (липидный бислой). Как вы уже знаете, каждая молекула фосфолипида образована полярной гидрофильной головкой и неполярными гидрофобными хвостами. В цитоплазматической мембране

гидрофильные головки обращены к наружной и внутренней сторонам мембраны, а гидрофобные хвосты — внутрь мембраны (рис. 30).

Кроме липидов, в состав мембран входят белки двух типов: интегральные и периферические. Интегральные белки более или менее глубоко погружены в мембрану либо пронизывают ее насквозь. Периферические белки располагаются на внешней и внутренней поверхностях мембраны, причем многие из них обеспечивают взаимодействие плазмалеммы с надмембранными и внутриклеточными структурами.

На внешней поверхности цитоплазматической мембраны могут располагаться молекулы олиго- и полисахаридов. Они ковалентно связываются с мембранными липидами и белками, образуя гликолипиды и гликопротеины. В клетках животных такой углеводный слой покрывает всю поверхность плазмалеммы, образуя надмембранный комплекс. Он называется гликокаликсом (от лат. гликис — сладкий, калюм — толстая кожа).

Функции цитоплазматической мембраны. Плазмалемма выполняет ряд функций,

важнейшими из которых являются барьерная, рецепторная и транспортная.

Барьерная функция. Цитоплазматическая мембрана окружает клетку со всех сторон, играя роль барьера — преграды между сложно организованным внутриклеточным содержимым и внеклеточной средой. Барьерную функцию обеспечивает, прежде всего, липидный бислой, не позволяющий содержимому клетки растекаться и препятствующий проникновению в клетку чужеродных веществ.

Рецепторная функция. В цитоплазматическую мембрану встроены белки, способные в ответ на действие различных факторов внешней среды изменять свою пространственную структуру и таким образом передавать сигналы внутрь клетки. Следовательно, цитоплазматическая мембрана обеспечивает раздражимость клеток (способность воспринимать раздражители и определенным образом реагировать на них), осуществляя обмен информацией между клеткой и окружающей средой.

Транспортная функция. Одной из основных функций плазмалеммы является обеспечение транспорта веществ как в клетку, так и из нее во внеклеточную среду. Выделяют несколько основных способов транспорта веществ через цитоплазматическую мембрану: простая диффузия, облегченная диффузия, активный транспорт и транспорт в мембранной упаковке.

Активный транспорт — перенос веществ через мембрану из области низкой концентрации этих веществ в область более высокой. Для этого в мембране имеются специальные насосы, работающие с использованием энергии (см. рис. 31). Чаще всего для работы мембранных насосов используется энергия АТФ.

Эндоцитоз (отгреч. эндон — внутри, китос — клетка, ячейка) — поглощение клеткой внешних частиц путем образования мембранных пузырьков. При эндоцитозе определенный участок плазмалеммы обволакивает внеклеточный материал и захватывает его, заключая в мембранную упаковку.

Экзоцитоз (от греч. экзо — снаружи) — транспортировка веществ, заключенных в мембранную упаковку, из клетки во внешнюю среду. Например, пузырек комплекса Гольджи перемещается к цитоплазматической мембране и сливается с ней, а содержимое пузырька выделяется во внеклеточную среду. Таким способом клетки выделяют пищеварительные ферменты, гормоны и другие вещества.

9.Внешняя мембрана грамотрицательных бактерий, её значение.

Уграмотрицательных бактерий оболочка клетки имеет более сложное строение, чем у грамположительных. Она содержит дополнительный барьер проницаемости — так называемую внешнюю мембрану, которая состоит из двойного слоя липополисахаридов и фосфолипидов. Внешняя мембрана содержит около 50 различных белков, многие из которых участвуют в переносе веществ, а также служат рецепторами для фагов и колицинов. Промежуток между плазматической мембраной и внешней мембраной грамотрицательных бактерий называется периплаз-матическим пространством или периплазмой. Здесь находится около 100 различных белков, участвующих в транспорте и катаболизме некоторых соединений.

Наружная мембрана имеет вид волнообразной трехслойной структуры, сходной с внутренней мембраной, называемой цитоплазматической мембраной.

Основной компонент этих мембран — бимолекулярный (двойной) слой липидов. Наружная мембрана является асимметричной мозаичной структурой, представленной липополиса-харидами, фосфолипидами и белками. С внешней стороны ее расположен липополисахарид (ЛПС), состоящий из трех компонентов липида А, базисной части, или ядра (от лат. ore — кор), и 0- специфической цепи полисахарида, образованной повторяющимися идентичными олигосахаридными последовательностями.

Наружная мембрана грамотрицательных бактерий выполняет не только механические, но и важные физиологические функции. В ее двойной липидный слой, состоящий из липида А, полисахаридов и фосфолипидов, встроены белки, пронизывающие этот слой насквозь. Вероятно, эти трансмембранные белки представляют собой заполненные водой каналы — гидрофильные поры в лйпофильной мембране поэтому их называют норинами. Существует несколько различных поринов. Они пропускают через мембрану гидрофильные низкомолекулярные вещества

10.Мезосомы: что это такое, где они располагаются, какова их биологическая роль.

Мезозомы они являются инвагинациями в плазматической мембране грамположительных и некоторых грамотрицательных бактерий, которые наблюдаются только в клетках, химически фиксированных для наблюдения в электронной микроскопии. Мезосомы — складчатые структуры, представляющие собой впячивания плазматической мембраны клетки. Во время клеточного деления мезосомы, по-видимому, ассоциируются с ДНК, что обеспечивает разделение двух дочерних молекул ДНК после репликации и способствует образованию перегородки между дочерними клетками. Точная роль мезосом в бактериальной клетке определена не окончательно. Вероятнее всего они служат для усиления мембранзависимых функциональных активностей клетки, поскольку в мембранах, образующих мезосомы, присутствуют ферменты, принимающие активное участие в энергетическом метаболизме бактерий

11. Нуклеоид бактерий: химическая природа, биологическая роль. В чём сходство и различие нуклеоида бактерий и ядра эукариот?

Нуклеоид бактерий — это область в их клетках, содержащая структурированный генетический материал. В отличие от ядра эукариот она не отделена мембраной от остального клеточного содержимого и не имеет постоянной формы. Несмотря на это генетический аппарат бактерий четко отграничен от цитоплазмы.

В состав нуклеоида бактерий входят три компонента: ДНК. Структурные и регуляторные белки. РНК. Обычно нуклеоид занимает центральный участок бактериальной клетки и ориентирован вдоль ее оси. В большинстве случаев хромосомы нуклеоида бактерий имеют замкнутую кольцевую форму. Значительно реже встречаются линейные хромосомы. В любом случае эти структуры состоят из одной молекулы ДНК, которая содержит набор генов, необходимых для выживания бактерии. В первую очередь нуклеоид необходим бактериям для того, чтобы хранить и передавать наследственную

информацию, а также реализовывать ее на уровне клеточного синтеза. Иными словами, биологическая роль этого образования такая же, как у ДНК. Другие функции нуклеоида бактерий включают: локализацию и компактизацию генетического материала; функциональную упаковку ДНК; регуляцию метаболизма. Структурирование ДНК не только позволяет молекуле уместиться в микроскопической клетке, но и создает условия для нормального протекания процессов репликации и транскрипции. Особенности молекулярной организации нуклеоида создают условия для контроля клеточного метаболизма путем изменения конформации ДНК. Регуляция происходит за счет выпетливания определенных участков хромосомы в цитоплазму, что делает их доступными для ферментов транскрипции, или наоборот, втягивания внутрь

12.Что такое плазмиды, где они располагаются, биологическая роль.

Плазмиды - внехромосомные генетические элементы, расположенные в цитоплазме а виде ковалентно замкнутых колец ДНК или интегрированные с хромосомой. Плазмиды придают бактериям дополнительные свойства: устойчивость к антибиотикам, способность к передаче генетического материала при конъюгации, продукция бактериоцинов, экзотоксинов и др.

13.Рибосомы, их локализация в клетке, биологическая роль.

Рибосо́ма — важнейшая немембранная органелла всех живых клеток, служащая для биосинтеза белка из аминокислот по заданной матрице на основе генетической информации, предоставляемой матричной РНК (мРНК). Этот процесс называется трансляцией.

Рибосомы присутствуют во всех типах клеток. Они образуются в ядре, затем выходят из него и размещаются в:

цитоплазме; митохондриях; пластидах;

на мембранах эндоплазматической сети (ЭПС). Рибосомы отвечают за биосинтез белков клетки.

14.Капсула бактерий: биологическая роль, что собой представляет? Какие патогенные бактерии образуют капсулу только в организме хозяина (человека или животного)? Какие бактерии называют капсульными?

Капсула клетки – поверхностная слизистая структура, образующаяся вокруг оболочки. Это аморфное вещество имеет большое значение для жизнедеятельности клетки, делает оболочку более прочной и плотной, служит защитным барьером на пути фагоцитов, иногда выполняет роль кладовой и хранит запасы пищи. В строении капсулы различают два слоя: внутренний, наружный. Внутренний слой – часть наружного слоя цитоплазмы клетки, а наружный – результат секреторной функции бактерии.

Капсула выполняет защитную функцию, предохраняя клетку во внешней среде от высыхания, а в организме хозяина - от фагоцитоза, разрушения под действием

антител и комплемента. Антитела против капсулы вызывают ее увеличение (реакция набухания капсулы).

Некоторые бактерии образуют капсулу только в организме хозяина, например, пневмококки, палочка сибирской язвы, палочка чумы; другие постоянно сохраняют ее, - это капсульные бактерии, например, клебсиеллы.

15.Биологическая роль спор бактерий. У каких морфологических форм споры встречаются чаще всего, очень редко, не встречаются?

Биологическая роль спор - сохранение вида в неблагоприятных условиях внешней среды.

Превращение бактериальной клетки в спору происходит при попадании бактерии во внешнюю среду, чаще всего - в почву. Спора формируется внутри клетки, затем

Споры чрезвычайно устойчивы и могут длительное время сохранять жизнеспособность: десятками лет остаются живыми в почве споры возбудителей сибирской язвы, столбняка, ботулизма. Они не погибают при 100°С, убить их можно только автоклавированием, сухим жаром при 160-170°С в течение 1-2 часов, или с помощью спороцидных химических веществ. При попадании в благоприятные условия (оптимальная температура, достаточная влажность, наличие питательных веществ) происходит прорастание спор в вегетативные формы. Прогревание спор при 100°С вызывает их тепловую активацию с последующим прорастанием. Это явление используется при стерилизации дробными методами.

16. Процесс образования споры, условия и время, необходимые для этого. Подготовительные стадии (стадии 0 и I). На этих стадиях в клетке еще нет морфологически видимых изменений, но умень шается количество воды и уплотняется цитоплазма.

Стадия проспоры (стадия II) является первой стадией спо-руляции, распознаваемой морфологически.

Она характеризуется по явлением проспоровой перегородки, которая делит клетку на ма ленькую проспору и большую материнскую клетку. Это ключевой этап споруляции.

В течение стадии поглощения проспоры (стадия III) про исходит пространственное обособление маленькой проспоры, кото рая переходит в цитоплазму материнской клетки.

Снаружи проспо ры образуется двойная мембранная структура.

Стадия предспоры характеризуется образованием кортекса (плотной споровой оболочки) внутри мембранной структуры проспоры (стадия IV) и конденсацией на его поверхности белков (стадия V).

На стадии созревания (стадия VI) споровая оболочка полу чает дальнейшее развитие и становится устойчивой к химическим агентам и нагреванию. Сформировавшаяся спора занимает примерно 1/10 часть материнской клетки.

Итоговой стадией является освобождение зрелой споры от материнской клетки

(стадия VII).

Процесс образования споры протекает в течение 18-20 часов.

17.Процесс прорастания вегетативных форм бактерий и спор, условия и время, необходимые для этого.

Прорастание споры в оптимальных условиях осуществляется в течение 2-3 ч; процент проросших спор увеличивается после соответствующей предварительной обработки. Например, споры могут быть активированы кратковременным прогреванием Прорастанию предшествует активация споры. Её инициируют различные

химические вещества, повышение температуры и влажности. Под воздействием автолизинов происходит расщепление кортекса, поглощение воды и набухание. Внешне процесс проявляется увеличением («вздутием») споры и уменьшением коэффициента светопреломления. При этом в споре происходят глубокие физиологические изменения: усиливается дыхание, увеличивается активность ферментов, происходит выделение аминокислот, дипиколиновой кислоты и пептидов (потеря сухой массы споры может достигать 20-30%). В этот период спора утрачивает терморезистентность. Затем спора лопается в произвольном месте и из неё выходит вегетативная клетка, снабжённая у подвижных видов жгутиковым аппаратом.

18.Чем объясняется устойчивость спор к внешним воздействиям?

Под действием неблагоприятных для микроорганизмов факторов (физических и химических) в процессе жизнедеятельности может изменяться ряд их признаков и свойств, которые в ряде случаев могут закрепляться и передаются по наследству. Так образуются устойчивые к лекарственным препаратам и другим вредным воздействиям микроорганизмы, имеющие по сравнению с исходными формами ряд новых признаков: измененную антигенную структуру, пониженную вирулентность и др. Устойчивость спор к действию физических и химических факторов затрудняет борьбу со спороносными патогенными бактериями, которые в виде спор могут сохраняться во внешней среде длительное время без потери своей

жизнеспособности. Прорастание спор в вегетативные клетки начинается при их попадании в благоприятные условия существования.

Устойчивость спор обусловлена тем, что:

1.Покровы труднопроницаемы из-за высокого содержания липидов, дипиколиновой кислоты и ионов кальция.

2.Подавлена активность ферментов

3.Низкое содержание воды. Предохранение белков от денатурации при высоких температурах.

4.Поверхностная структура, начиная с внутренней мембраны механически защищает содержание споры от проникновения агрессивных веществ.

5.Высокая устойчивость спор к различным воздействиям связана с наличием плотной многослойной оболочки, низким содержанием воды в ней и отсутствием ферментативной активности. Одним из важнейших факторов, обусловливающих высокую устойчивость спор, является присутствие

кальциевой соли дипиколиновой кислоты; содержание кальция в спорах значительно выше, чем в вегетативных телах.

19. Как могут располагаться споры в клетке бактерии? Назовите виды бактерий с различным расположением спор.

Расположение в клетке -терминальное, т.е. на конце палочки (у возбудителя столбняка), субтерминальное - ближе к концу палочки (у возбудителей ботулиэма, газовой гангрены) и центральное (у сибиреязвенной бациллы)

ё

20.Латинские названия спорообразующих палочковидных форм бактерий.

Палочковидные бактерии (устаревшее — бациллы от лат. Bacilli —

«палочки») — бактерии палочковидной формы. Сейчас название «бациллы» используют для обозначения представителей рода Bacillus. Морфологически выделяют еще так называемые коккобацилы — округлые клетки, длина которых еще заметно превышает ширину (в частности как в Bacteroides fragilis, Yersinia pestis, Bordetella bronchiseptica, Haemophilus influenzae). Палочковидная форма встречается у большинства видов бактерий, как грамотрицательных, так и грамположительных. Палочковое форма является самой многочисленной и разнообразной группой бактерий.

21.Способ окраски спор.

Для окраски спор применяют способ Ожешки, основанный на их кислотоустойчивости.

Окраска по методу Ожешко для выявления спор

1.На высушенный нефиксированный препарат (мазок готовится толстым и на краю стекла) наливают несколько капель 0,5%-ного раствора соляной кислоты и подогревают 1 – 2 мин. над пламенем горелки до закипания, после чего остатки кислоты сливают.

2.Остывший препарат промывают водой, подсушивают на воздухе и фиксируют на пламени горелки.

3.Окрашивают карболовым фуксином Циля (фуксин наливают на фильтровальную бумажку) с подогреванием до появления паров.

4.Обесцвечивают 5%-ным раствором серной кислоты в течение нескольких секунд.

5.Промывают водой.

6.Докрашивают синькой Леффлера или 1%-ным водным раствором малахитовой зелени в течение 3 – 5 мин.

Споры, окрашенные фуксином, имеют рубиново-красный цвет, вегетативные тела микробных клеток при докрашивании синькой Леффлера – синий цвет, при применении малахитовой зелени – зеленый цвет.

22.Жгутики бактерий - биологическая роль.

На поверхности ряда бактери-ых клеток располагаются жгутики. В их состав входит белок флагелин, кот-ый по своей структуре относится к сократительным белкам типа миозина. Жгутики прикрепляются к базальному телу, состоящему из сис-мы нескольких дисков, вмонтированных в цитоплазматическую мем-ну и КС. Кол-во и расположение жгутиков у разных бактерий неодинаково. Монотрихи имеют на одном из полюсов клетки тлько один жгутик, лофотрихи — пучок жгутиков, у амфитрихов жгутики расположены на обоих полюсах клетки, а у перитрихов — по всей ее поверхности.

Активная подвижность бактерий обусловлена вращательными движениями жгутиков, подобно корабельному винту, либо пропеллеру (монотрихи, лофотрихи). Наряду с беспорядочным движением бактерии могут передвигаться направленно путем хемотаксиса, аэротаксиса, обусловленного разной конц-цией кислорода, и фототаксиса. Скорость движения бактерий связана с расположением жгутиков, составом и св-вами пит-ой среды.Жгутики обладают антигенными св-вами.

Грамположительные бактерии имеют 2 диска, грамотриц-е — 4 диска.

Жгутики выявляются: электронная микроскопия, по Лефлеру.

2.Метод Циля—Нильсена в модификации Мюллера. Мюллер, модифицировав известный метод Циля—Нильсена, применяемый обычно для выявления кислотоустойчивости бактерий (дифференциальной окраски микобактерий и некоторых близких к ним микроорганизмов), снизанной с особенностями химического состава их оболочки, предложил использовать его для окраски спор бактерий.

3.Метод Пешкова. На фиксированный в пламени препарат наливают метиленовый синий Леффлера, доводят его до кипения и кипятят 15—20 с, держа стекло над пламенем. Мазок промывают водой и докрашивают в течение 30 с 0,5%-ным водным раствором нейтрального красного. Еще раз промывают, подсушивают и далее исследуют препарат с масляной иммерсией объектива. Споры окрашиваются в голубой или синий цвета, цитоплазма — в розовый.

Для исследования спор удобными объектами могут служить Bacillus mesentericus или

Bacillus mycoides в возрасте 4 сут.

Реактивы для окрашивания спор бактерий.

1.Карболовый фуксин Циля.

2.Метиленовый синий Леффлера.

3.Насыщенный водный раствор метиленового синего 2 г красителя и 100 мл дистиллированной воды.

4.Хромовая кислота, 5%-ный раствор.

5.Соляная (или серная) кислота, 1%-ный раствор.

23. Как разделяются бактерии по количеству и расположению жгутиков? Почему жгутики не видны в обычных препаратах? Как можно увидеть жгутики бактерий? Как можно косвенным образом судить о наличии жгутиков у бактерий, какие препараты для этого готовят? Можно ли без помощи микроскопа определить наличие жгутиков у бактерий?

Классификация бактерий по числу и расположению жгутиков:

1.Атрихи— жгутики отсутствуют.

2.Монотрихи — один жгутик, расположенный на одном из полюсов клетки (род Vibrio) — монополярное монотрихальное расположение жгутиков, самые подвижные бактерии.

3.Политрихи — много жгутиков.

4.Перитрихи – жгутики по всей поверхности.

5.Лофотрихи – пучок жгутиков на одном конце.

Размеры жгутиков (толщина 10-20 нм, длина 3-15 мкм) не позволяют их увидеть в обычном световом микроскопе без особого метода сверхокраски, например, метод серебрения, при котором жгутики искусственно утолщаются и становятся видимыми в иммерсионном микроскопе.

Изучать подвижность бактерии можно как с помощью микроскопических методов (фазово-контрастная микроскопия препаратов «висячая» или «раздавленная» капля), так и посевном уколом в полужидкий агар.

Выявление жгутиков:

1)Косвенное – по факту подвижности бактерий.

2)Прямое – специальные методы окраски, фазово-контрастная микроскопия (у лофотрихов), электронная микроскопия.

Оналичии жгутиков можно косвенно судить по направленному характеру движения в «висячей» и «раздавленной» капле в темнопольном и фазово-контрастном микроскопах, либо при светлопольной микроскопии при опущенном конденсоре и частично прикрытой диафрагме микроскопа.

Окраска жгутиков методом Леффлера

В основе выявления жгутиков лежит осаждение на них красителя, чем достигается увеличение толщины жгутиков и уменьшение их прозрачности.

1. Препарат готовят из 16-18 часовой культуры, которую вносят в 1-2 мл стерильной водопроводной воды до получения тонкой опалесцирующей взвеси.

2.Через 20 мин капля суспензии наносят на поверхность чистого обезжиренного стекла и высушивают на воздухе.

3.Обрабатывают в течение 15 мин протравой следующего состава: 1 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина, 10 мл 25% водного раствора таннина, 5 мл насыщенного водного раствора сернокислого железа.

4.Препарат промывают водой.

5.Окрашивают карболовым фуксином Циля, разведенным водой в соотношении 1:1, в течение 5 мин при легком подогревании.

6.Промывают водой, высушивают.

При микроскопии готового препарата жгутики видны как тонкие нитевидные структуры.

Рассмотреть жгутики можно только в электронном микроскопе. В световом микроскопе без специальной обработки жгутики не видны.

24. Внутриплазматические включения у бактерий - биологическая роль. Приведите пример, у каких патогенных бактерий встречаются, как называются, каким способом окрашиваются?

Внутрицитоплазматические включения подразделяются на активно функционирующие структуры и продукты клеточного метаболизма,не выделяющиеся наружу, а откладывающиеся внутри клетки.

Кпервой группе внутриплазматических включений относятся газовые вакуоли, или аэросомы, обнаруженные у бактерий, обитающих в воде. Аэросомы снижают удельную массу бактериальной клетки и благодаря этому поддерживают ее во взвешенном состоянии в водоеме. Аэросома представляет собой скопление газовых пузырьков (везикул), Которые имеют веретенообразную форму. Их оболочка состоит только из белка, т. е. устроена не так, как обычная мембрана. Белковые молекулы ориентированы таким образом, что внутренняя сторона оказывается гидрофобной, а наружная – гидрофильной.

Кпервой группе включений относятся также хлоросомы зеленых бактерий и фикобилисомы цианобактерий. В этих структурах локализованы пигменты, поглощающие кванты света и передающие энергию возбуждения на фотореакционные центры, т. е. они принимают непосредственное участие в фотосинтезе. Это эллипсовидные образования, окруженные тонкой белковой оболочкой (толщиной 2,5– 3,0 нм), которая состоит из отдельных глобул.

Карбоксисомы, или полиэдрические тела, содержатся в клетках некоторых автотрофных бактерий. Они имеют форму многогранника диаметром 90–100 нм, окруженного однослойной белковой оболочкой. В карбоксисомах содержится рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилаза – ключевой фермент, катализирующий фиксацию СО2 в цикле Кальвина в процессе фото- и хемосинтеза.

Магнитосомы содержатся в водных бактериях, способных ориентироваться в магнитном поле и перемещаться в направлении линий магнитного поля. В их состав входит 0,4 % железа (по сухому веществу). Магнитосомы располагаются в клетках вблизи мест прикрепления жгутиков.

Ко второй группе включений (продуктам клеточного метаболизма) относятся запасные вещества – полифосфаты, полисахариды, жиры, сера. Эти вещества накапливаются, если в питательной среде находятся соответствующие исходные соединения, но вместе с тем рост бактерий ограничен или вообще невозможен из-за недостатка каких-то отдельных компонентов питания или же присутствия ингибиторов. Запасные вещества содержатся в клетках в осмотически инертной форме, т. е. не растворимы в воде. В условиях, благоприятных для роста, когда в этих веществах возникает потребность, они снова включаются в метаболизм.

25.Ворсинки (пили, фимбрии) бактерий, где располагаются? Название ворсинок первого типа, примерное число их у клетки, биологические функции. Название ворсинок второго типа, примерное число ворсинок, биологическая роль.

Ворсинки (пили, фимбрии) бактерий, где располагаются? Название ворсинок первого типа, примерное число их у клетки, биологические функции. Название ворсинок второго типа, примерное число ворсинок, биологическая роль.

Ворсинки или пили (фимбрии) тонкие полые нити белковой природы, более тонкие и короткие (3-10 нм х 0,3-10 мкм), чем жгутики. Пили отходят от поверхности клетки и состоят из белка пилина.

Пили 1-го типа, или общего типа – common pili – пили, ответственные за адгезию, т.е. за прикрепление бактерий к поражаемой клетке. Они начинаются на цитоплазматической мембране и пронизывают клеточную стенку. Их количество велико – от нескольких сотен до нескольких тысяч на одну бактериальную клетку.

Пили 2 типа (половые, F-пили, конъюгативные – sex pili) участвуют в конъюгации бактерий, обеспечивающей перенос части генетического материала от донорской клетке к реципиентной. Они имеются только у бактерий-доноров в ограниченном количестве (1-4 на клетку), более длинные (0,5-10 мкм). Отличительной особенностью половых пилей является взаимодействие с особыми «мужскими» сферическими бактериофагами, которые интенсивно адсорбируются на половых пилях.

26.Что такое L-формы бактерий, чем они отличаются от исходных форм?

Бактерии, полностью или частично утратившие клеточную стенку, но сохранившие способность к размножению, получили название L-форм. Независимо от формы исходной клетки (кокки, палочки) L-формы этих бактерий морфологически неразличимы. Они представляют собой сферические образования разных размеров. L- формы могут возникать в естественных условиях в организме человека в результате длительного лечения некоторыми антибиотиками, чаще всего пенициллином.

Различают нестабильные и стабильные L-формы бактерий. Первые способны к реверсии в исходный вид при устранении причины, вызвавшей их образование. Они восстанавливаютют способность синтезировать пептидогликан КС. Вторые, как

правило, не способны к реверсии. L-формы разных бактерий играют существенную роль в патогенезе многих инфекционных заболеваний.

Основные свойства L-форм бактерий:

-постоянное превращение из грамположительных в грамотрицательные.

-изменение антигенных св-в

-снижение вирулентности

-способность к длительной персистенции

-способность при неполной утрате синтеза КС к возврату в исходную форму.

27.Устройство и принцип работы микроскопов: тёмнопольного, фазовоконтрастного, люминесцентного, электронного.

Темнопольная микроскопия. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Эффект достигается с помощью параболоидили кардиоид-конденсора, которые заменяют обычный конденсор в биологическом микроскопе. Неокрашенные живые культуры микроорганизмов наблюдают также в препарате «разбавленная» капля с помощью данного метода, который позволяет несколько расширять разрешающую способность микроскопа. Микроскопия в темном поле основана на освещении объекта косыми лучами света. Поле зрения выглядит совершенно черным, а объекты, например микробные клетки, находящиеся в препарате, интенсивно светятся. Просматривают препарат, пользуясь объективом х40.

Фазово-контрастная микроскопия. Фазово-контрастное приспособление дает возможность увидеть в микроскоп прозрачные объекты. Они приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной или негативной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изображение объекта в светлом поле зрения, негативным — светлое изображение объекта на темном фоне. Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное устройство, а также специальные осветители. При прохождении света через микробную клетку за счет разницы в показателях преломления структур клетки происходит изменение фазы проходящих световых лучей. Фазово-контрастное устройство позволяет оптическим путем превращать различия по фазе в изменение амплитуды света, в результате чего живые прозрачные объекты становятся контрастными, хорошо видимыми глазом.

Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия. Основана на явлении фотолюминесценции. Люминесценция — свечение веществ, возникающее после воздействия на них каких-либо источников энергии: световых, электронных лучей, ионизирующего излучения. Фотолюминесценция — люминесценция объекта под влиянием света. Если освещать люминесцирующий объект синим

светом, то он испускает лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цвета. В результате возникает цветное изображение объекта. Флюоресценция – свечение микроскопических объектов, возбуждаемое поглощенной световой энергией. Для люминесцентной микроскопии необходимы источник ультрафиолетового или сине-фиолетового света и набор оптических светофильтров для отделения флюоресценции от падающего света. Микроскопические препараты обрабатывают специальными красителями – флюорохромами.

Электронная микроскопия. Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмикроскопических объектов. В электронном микроскопе пучок света заменен потоком электронов. Длина волны электронных лучей во много раз короче длины световых лучей, что позволяет большее увеличение и рассматривать объекты, невидимые в световом микроскопе. В электронном микроскопе линзами являются электрические или магнитные поля соответствующей конфигурации. Источник электронов – катод. Исследуемый материал наносят на тонкие пленки и помещают на пути потока электронов.