mikra_ekz_15_37_59_81
.docx15. Питательные среды. Требования, предъявляемые к питательным средам. Классификация питательных сред.
Питательные среды — это субстраты, на которых выращивают микроорганизмы и тканевые культуры. Они применяются для диагностических задач, выделения и изучения чистых культур микроорганизмов, получения вакцин и лекарств.
Требования, предъявляемые к питательным средам:
а) среды должны быть питательными – содержать все необходимые для жизнедеятельности вещества;
б) иметь определенное значение рН – для большинства патогенных микробов оптимальным является рН 7,2-7,4;
в) обладать буферностью – содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена микроорганизмов, для того чтобы не изменялось значение рН среды;
г) быть изотоничными - осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки;
д) быть стерильными для получения чистой культуры;
е) содержать достаточное количество Н2О, т.к. бактерии питаются по законам осмоса и диффузии;
ж) обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, для аэробов rH2 – не ниже 10; для анаэробов – не выше 5;
з) быть прозрачными.
Классификация сред:
По консистенции среды делят на:
а) жидкие: мясопептонный бульон (МПБ);
б) полужидкие: полужидкий мясопептонный агар (МПА);
в) плотные или твердые: МПА, мясопептонный желатин, свернутая сыворотка;
г) сыпучие: разваренное пшено, кварцевый песок;
д) сухие – гигроскопические порошки, выпускаемые промышленностью;
По составу среды делят на:
а) естественные – натуральные продукты (яйца, овощи), животные ткани, желчь, сыворотка крови;
б) искусственные – среды, приготовленные из различных настоев или отваров с добавлением неорганических солей, углеводов, азотистых веществ;
в) синтетические – среды, приготовленные из определенных химических соединений в точно указанных концентрациях.
По назначению среды делят на:
а) основные (простые) – используют для культивирования многих видов микроорганизмов: МПБ, МПА; на простых средах хорошо растут прототрофные бактерии; простые среды служат основой для приготовления ряда сложных питательных сред;
б) специальные (сложные) - используют для тех микроорганизмов, которые не растут на простых средах: сахарный МПБ, сахарный МПА, кровяной МПА;
в) элективные (избирательные) – используют для определенных видов; создаются оптимальные условия для этих видов, а другие виды не растут или растут плохо: щелочная ПВ (для холерного вибриона), среда Сабуро (для грибов), желточно-солевой агар (для стафилококка), сывороточные среды – среда Ру и среда Леффлера (для дифтерийных коринебактерий), среда Китта-Тароцци (для анаэробов), среды с желчью (для тифо-паратифозных бактерий), среды с глицерином (для микобактерий туберкулеза);
г) дифференциально-диагностические среды используют для изучения биохимических свойств и дифференцировки (отличия) одного вида микроорганизмов от другого по его ферментативным свойствам: среды Эндо, Левина, Плоскирева, среды Гисса. Эти среды применяются для дифференциации бактерий кишечной группы по их способности сбраживать лактозу. Состав сред подбирается так, чтобы выявить характерные отличия ферментативных свойств одного вида от другого.
Среда Эндо состоит из МПА, 1 % лактозы, фуксина и сульфита натрия, который его обесцвечивает, исходная среда имеет светло-розовый цвет.
Среда Левина состоит из МПА, лактозы, эозина, метиленовой сини и фосфорнокислого натрия, исходная среда имеет красно-фиолетовый цвет.
Среда Плоскирева состоит из МПА, лактозы, бриллиантового зеленого, йода, нейтрального красного, солей желчных кислот, минеральных солей. Эта среда также является элективной, т.к. подавляет рост многих микробов (кишечной палочки и др.) и способствует лучшему росту некоторых болезнетворных бактерий (возбудителей брюшного тифа, паратифов).
Среды Гисса («пестрого» ряда) готовятся на основе жидкой среды (пептонной воды) или полужидкого мясо-пептонного агара. Среды Гисса содержат какой-либо углевод или многоатомный спирт (лактозу, глюкозу, маннит, сахарозу) и индикатор, который изменяет свой цвет в кислой среде. В пробирку с жидкой средой Гисса помещен стеклянный поплавок. Если на среду Гисса посеять микроб, который сбраживает данный субстрат с образованием кислоты и газа, т.е. до конечных продуктов, то среда изменит свой цвет, в полужидкой среде появятся пузырьки и разрывы в толще агара, в жидкой среде – пузырек газа в поплавке. При сбраживании субстрата только до промежуточных продуктов (до кислоты) происходит только изменение цвета среды.
Также существуют комбинированные среды, содержащие не один углевод, а два, три, например среда Олькеницкого - трехсахарный агар с мочевиной. Среда готовится на основе не очень плотного МПА. Содержит лактозу (1%), сахарозу (1%), глюкозу (0,1%), мочевину, соль Мора (сульфат железа), гипосульфит натрия и индикатор. Среду после стерилизации в расплавленном виде наливают в пробирку и дают застыть так, чтобы получился столбик и скошенная часть. Посев производится штрихом по скошенной части и затем уколом в столбик.
При сбраживании углеводов, которые содержатся в среде в большем количестве (лактозы, сахарозы), изменяется цвет всей среды, при сбраживании глюкозы изменяется цвет столбика, а скошенная часть остается без изменений. Образование газа определяется по наличию пузырьков в столбике агара. Культуры, расщепляющие мочевину с образованием аммиака, дают щелочную реакцию. При этом происходит нейтрализация кислоты, образующейся при сбраживании углеводов, и цвет среды не изменяется. Добавление соли Мора и гипосульфита позволяет также изучить способность бактерий к образованию сероводорода по почернению в столбике агара в результате превращения сульфата железа в сульфид черного цвета.
37. Микробиологический контроль аптечной посуды, инвентаря, оборудования, рук персонала. Исследование воздуха в аптечных учреждениях. Отбор проб, методики исследования, оценка результата.
Аптечную посуду, подготовленную для разлива инъекционных растворов и глазных капель, отбирают в момент приготовления их в количестве 3 штук одинаковой ёмкости. Флаконы доставляют в лабораторию в укупоренном виде, используя при этом аптечные пробки и прокладки. Доставленные в лабораторию флаконы последовательно ополаскивают 10 мл стерильной водопроводной воды. Воду из флакона во флакон переливают над пламенем горелки, тщательно ополаскивая каждый флакон. Пробки (корковые и полиэтиленовые) и прокладки отбирают в момент приготовления инъекционных растворов и глазных капель фламбированным пинцетом и помещают по 5 штук в широкогорлые стерильные колбы или банки с последующим закрытием стерильными ватно-марлевыми пробками и бумажными колпачками. В лаборатории в колбы или банки наливают 10 мл стерильной водопроводной воды и тщательно ополаскивают. Используемые в аптеках пипетки прополаскивают несколько раз в пробирке, содержащей 10 мл стерильной водопроводной воды, пробирки со смывной жидкостью доставляют в лабораторию. Определение в смывной жидкости количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных бактерий проводится, как описано в пункте 1. Число колоний, установленное в 1 мл смывной жидкости, умножают на 10, что соответствует содержанию бактерий на всей смывной поверхности. Количество бактерий не должно превышать 150. Определение наличия БГКП: 8 мл оставшейся смывной жидкости засевают в 1 мл концентрированной среды Эйкмана, инкубируют при 37ºС в течение суток и в дальнейшем идентифицируют БГКП. Наличие бактерий группы кишечной палочки не допускается.
Смывы с инвентаря, оборудования, рук персонала (во время приготовления лекарственных форм), санитарной одежды осуществляют с помощью ватных тампонов, помещённых в пробирки с физраствором. Влажным тампоном протирают исследуемую поверхность, затем тампон помещают в среду Кесслера или Кода. После инкубации в термостате пересевают на среду Эндо и определяют наличие БГКП. Определение патогенных (золотистых) стафилококков осуществляют путём посева смыва в пробирку с солевым МПБ. После инкубации в термостате определяют наличие стафилококков. Количественные определения их не проводятся. Наличие БГКП и стафилококков не допускается.
Исследование воздуха. Отбор проб воздуха производится при соблюдении следующих условий: - чистое подготовленное к работе помещение; - закрытые форточки и двери; - уровень высоты отбора воздуха соответствует высоте рабочего стола.
59. Возбудитель сибирской язвы: название по латыни, морфология, отношение к окраске по Граму, питательные среды для культивирования, источник и механизм заражения, материалы для исследования и методы лабораторной диагностики, препараты для специфической профилактики и лечения.
Возбудитель (Bacillus anthracis) относится к отделу Firmicutes, роду Bacillus, семейству Bacillaceae.
Морфология: крупные грамположительные палочки, неподвижные (нет жгутиков), имеют обрубленные концы, которые расположены в цепочку, в внешней среде образуют центральную спору, в организме человека и животных образуют капсулу
Питательные среды для культивирования: аэробы, хорошо растут на простых питательных средах. В МПБ растут в виде комочка ваты на дне, МПБ - прозрачный. На МПА - колонии в Rформе, крупные, напоминающие львиную гриву. Разжижают желатин в виде опрокинутой елочки. Характер роста на средах имеет диагностическое значение. Биохимические свойства выражены хорошо. Разлагают глюкозу, лактозу и мальтозу до кислоты. Свертывают молоко.
Источник и механизм заражения: Основной источник - больные животные (травоядные). Пути передачи: 1) контактно-бытовой - при уходе за животными, снятии шкуры, при изготовлении предметов и изделий и их использовании (изделия из кожи, шерсти - полушубки, меховые рукавицы, шапки, воротники, кисточки для бритья, шерстяные платки, шарфы и т.д.); 2) пищевой (алиментарный) - при употреблении мяса больных животных; 3) воздушно-капельный — при вдыхании пыли и др. со спорами; 4) трансмиссивный - через укусы кровососущих насекомых. Восприимчивость людей всеобщая. Больной человек не заразен для окружающих. Уровень заболеваемости среди людей зависит от распространения эпидемии среди животных. Заболевание часто носит профессиональный характер и наблюдается у рабочих животноводческих ферм и кожевенных заводов.
Патогенез и клиника: Входные ворота: кожа, слизистые оболочки дыхательных путей, пищеварительный тракт. Основной патогенетический фактор - экзотоксин, который вызывает отек, некроз тканей и другие повреждения. Инкубационный период от нескольких часов до 8 дней. Различают 3 формы сибирской язвы: 1) кожная форма; 2) кишечная форма; 3) легочная форма. Чаще бывает кожная форма - 65% случаев. Вначале на коже образуется красное пятно, потом сибиреязвенный карбункул, он вскоре покрывается буро-черной коркой, напоминающий уголь — антрацит, он почти безболезненный. Болезнь может длиться от недели до месяца. Больные, как правило, выздоравливают. Кишечная и легочная сибирская язва - очень тяжелые формы заболевания. Развиваются интоксикация и геморрагические поражения кишечника и легких. Летальность высокая.
Формируется стойкий иммунитет. Возможны рецидивы. Лабораторная диагностика. Исследования проводят в специальных лабораториях.
Материалы для исследования и методы лабораторной диагностики:
Материал для исследования:
1. Содержимое везикул, карбункула, отторгнутый струп (кожная форма).
2. Мокрота (легочная форма).
3. Испражнения (кишечная форма).
4. Кровь (септическая форма).
5. Почва, шерсть животных (для постановки реакции Асколи).
6.Трупный материал.
Основные методы исследования:
1) бактериоскопический метод - из исследуемого материала готовят мазок, красят по Граму или Бурри-Гинсу для выявления капсулы;
2) бактериологический метод - делают посев материала на среды для получения чистой культуры и проводят ее идентификацию, нередко применяют фагодиагностику (в отличие от антракоидов, сибиреязвенные палочки на кровяном агаре не дают гемолиза);
3) биологический метод - исследуемым материалом заражают морских свинок или белых мышей подкожно или внутрибрюшинно, животные погибают на 2-3 день;
4) серологический метод - ставят реакцию кольцепреципитации по Асколи с целью обнаружения сибиреязвенного антигена в сырье (коже, шерсти, трупном материале), из которого трудно выделить чистую культуру (для этого: а)материал подвергают кипячению в физ. растворе, фильтруют и получают преципитиноген; б) в преципитационную пробирку наливают преципитирующую сибиреязвенную сыворотку, на нее наслаивают преципитиноген; в) при положительной реакции на границе двух жидкостей появляется белое, мутное кольцо, что говорит о соответствии антигена антителам сыворотки, т.е. о наличии белков возбудителя сибирской язвы в материале);
5) кожно-аллергическая проба с антраксином — внутрикожное введение аллергена.
Препараты для специфической профилактики и лечения: Профилактика – для специфической профилактики применяют живую сибиреязвенную вакцину - СТИ, представляющую собой споровую культуру бескапсульного варианта сибиреязвенных бацилл. Прививают работников животноводства в населенных пунктах, неблагополучных по сибирской язве. Для экстренной профилактики (если человек заразился) вводят сибиреязвенный иммуноглобулин и пенициллин. Общая профилактика: своевременное выявление и лечение больных животных, проведение тщательной дезинфекции помещений для скота, захоронение погибших животных в специальных скотомогильниках на глубину не менее 2 м.
Лечение – противосибиреязвенный иммуноглобулин, антибиотики: пенициллин, стрептомицин, тетрациклин.
81. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ): таксономическое положение, структура, антигены, источники инфекции и механизмы заражения, стадии болезни, материалы для исследования и методы лабораторной диагностики, меры профилактики, лечебные препараты.
Таксономическое положение: Вирус иммунодефицита человека относится к порядку Ortervirales, семейству Retroviridae подсемейству Orthoretrovirinae, роду Lentivirus. Вирусы иммунодефицита человека 1 и 2 имеют название (Human immunodeficiency virus 1, HIV-1 и Human immunodeficiency virus 2, HIV-2).
Структура: РНК-содержащий вирус. Вирусная частица сферической формы Оболочка состоит из двойного слоя липидов, пронизанного гликопротеинами. Липидная оболочка происходит из плазматической мембраны клетки хозяина, в которой репродуцируется вирус. Гликопротеиновая молекула состоит из 2 субъединиц, находящихся на поверхности вириона и пронизывающих его липидную оболочку.
Сердцевина вируса конусовидной формы, состоит из капсидных белков, ряда матриксных белков и белков протеазы. Геном образует две нити РНК, для осуществления процесса репродукции ВИЧ имеет обратную транскриптазу, или ревертазу.
Геном вируса состоит из 3 основных структурных генов и 7 регуляторных и функциональных генов. Функциональные гены выполняют регуляторные функции и обеспечивают осуществление процессов репродукции и участие вируса в инфекционном процессе. Вирус поражает в основном Т- и В-лимфоциты, некоторые клетки моноцитарного ряда (макрофаги, лейкоциты), клетки нервной системы.
Антигены: Антигенными свойствами обладают поверхностные гликопротеины (gp160, gp120, gp41), внутренние белки (р24, р18 и др.) и нуклеопротеиды р7, р9.
В настоящее время выделяют две антигенные разновидности вируса: ВИЧ-1, ВИЧ-2. К основным антигенам у инфицированных людей образуются антитела. Вначале появляются АТ к gp120, gp41, затем к р24, которые длительно сохраняются в крови.
Интенсивная антигенная изменчивость ВИЧ дает возможность вирусу «скрыться» от специфических антител и факторов клеточного иммунитета, что приводит к хронизации инфекции. С другой стороны, повышенная антигенная изменчивость затрудняет создание вакцины для профилактики ВИЧ-инфекции.
Источники инфекции и механизмы заражения: Источником инфекции являются больной и вирусоноситель. ВИЧ выделяется со всеми биологическими жидкостями. В достаточной для заражения концентрации вирус содержится в сыворотке крови и в сперме.
Механизм передачи – парентеральный, через кровь и другие биологические жидкости.
Стадии болезни: Инкубационный период длится в среднем 1-3 мес, однако может быть 3-10 лет. В этот период скрытого вирусоносительства могут увеличиваться лимфоузлы и появляться антитела. Первичная реакция организма на внедрение ВИЧ обычно сопровождается выработкой антител. Однако от момента заражения до выработки антител обычно проходит в среднем от трех недель до трех месяцев, у 15-25% инфицированных появление антител к ВИЧ в организме совпадает с клиническими проявлениями. Выделяют несколько стадий болезни, переходящих одна в другую.
I. Острая инфекция. Чаще всего встречается между 6-12 неделей после инфицирования, но может появиться через 1 неделю, 8-12 месяцев и позже. Наблюдается мононуклеозоподобный синдром (лихорадка, моноцитоз). Эта стадия может протекать в субклинической форме.
II. Асимптомная инфекция (вирусоносительство). Характеризуется отсутствием каких-либо симптомов. Отнесение лиц к этой группе осуществляется на основании данных эпидемиологического анамнеза и лабораторных исследований. Доказательством служит наличие противовирусных антител.
III. Персистирующая генерализованная лимфаденопатия.
Характеризуется наличием выраженной лимфоаденопатии в течение трех и более месяцев у лиц с эпидемиологическими и лабораторными данными.
IV. СПИД-ассоциированный симптомокомплекс (пре-СПИД). Эта стадия характеризуется следующими признаками: потерей массы тела до 10% и более; необъяснимой лихорадкой на протяжении 3-х месяцев и более; диареей, длящейся более 1 месяца; синдромом хронической усталости; грибковыми, вирусными, бактериальными поражениями кожи и слизистых; повторным или диссеминированным опоясывающим лишаем, саркомой Капоши; повторными или стойкими вирусными, бактериальными, грибковыми, протозойными поражениями внутренних органов.
V. СПИД. Нарастают оппортунистические инфекции и опухоли в результате развития глубокого иммунодефицита, истощения, что приводит к смерти через 5-10 лет. В ряде случаев заболевание развивается более быстро и уже через 2-3 года переходит в терминальную стадию.
Материалы для исследования и методы лабораторной диагностики: исследуют сыворотку больного на наличие АТ к антигенам вируса ВИЧ. У 90% больных антитела появляются в течение первых 3 месяцев после заражения, у 5-9% – через 6 месяцев, а у 1% – позже. Это исследование проводят в 2 этапа: на первом из них определяют АТ к вирусным белкам при помощи иммуноферментного анализа (ИФА). На втором этапе положительные сыворотки исследуют методом иммуноблотинга, в котором выявляют антитела против индивидуальных антигенов вируса. При выявлении антител не менее чем к трем антигенам (gp120, gp41, р24) человека считают ВИЧ-инфицированным.
Методом ПЦР определяют РНК вируса в плазме крови, что используется для контроля за лечением.
Меры профилактики: 1. Выявление ВИЧ-инфицированных лиц среди угрожаемых контингентов (лица, контактные с инфицированными, проститутки, наркоманы).
2. Предупреждение инфицирования медицинского инструментария, лекарств, препаратов крови.
3. Пропаганда знаний по предупреждению заражения ВИЧ при половых контактах (исключение случайных связей, применение средств индивидуальной защиты).
4. Предупреждение заражения медработников при контакте с больными и их биологическими жидкостями (кровь, секреты, экссудаты, моча и т.д.).
Лечебные препараты: применение ингибиторов обратной транскриптазы, действующих в активированных клетках. Препараты являются производные тимидина — азидотимидин и фосфазид.