mikr2

12. Методы приготовления препаратов для изучения морфологии микробов в живом и в окрашенном состоянии. Этапы приготовления мазка. Простые и сложные методы окраски микробов.

Приготовление фиксированных препаратов из культур микроорганизмов

Приготовление окрашенного препарата из культуры микроорганизмов включает: 1) приготовление мазка, 2) высушивание мазка, 3) фиксацию, 4) окраску.

Приготовление мазка. При приготовлении мазка из культуры микроорганизмов, выросшей на поверхности плотной питательной среды, на обезжиренное предметное физиологического раствора, располагая её в центре круга, нарисованного с обратной стороны карандашом по стеклу. При работе спиртовка должна находиться прямо перед вами, на удобном для работы расстоянии. Предметное стекло должно находиться в чашке Петри или лотке: категорически запрещается готовить мазки на предметном стекле, лежащем на столе! В правую руку берут бактериологическую петлю, в левую-пробирку с культурой. Петлю стерилизуют, внося её в пламя горелки в вертикальном положении. После того как петля раскалится докрасна, проводят конец петледержателя через пламя. После этого из пробирки вынимают пробку, удерживая её мизинцем правой руки. После обжигания на спиртовке края пробирки в неё вносят петлю, которую охлаждают, прикасаясь к стенкам пробирки. Затем петлей с поверхности среды снимают небольшое количество культуры. Нe касаясь стенок пробирки, вынимают петлю и закрывают пробирку пробкой над спиртовкой. После этого пробирку с культурой помещают в штатив, а культуру на петле вносят в приготовленную заранее каплю физиологического раствора, хорошо размешивают и равномерно распределяют по стеклу в виде небольшого круга или овала 1-1,5 см в диаметре. По окончании приготовления мазка петлю вновь стерилизуют в пламени спиртовки.

Для приготовления мазка из бульонной культуры на предметное стекло наносят 1-2 петли исследуемого материала, стерилизуя петлю перед каждым погружением в бульонную культуру микроорганизма, как описано выше, и равномерно распределяют по стеклу (в этом случае не требуется нанесения на стекло физиологического раствора).

Высушивание мазка. Высушивание мазка производится на воздухе. Для ускорения высушивания предметное стекло с мазком, обращённым кверху. можно подержать в струе тёплого воздуха высоко над пламенем спиртовки, не стеклу внося препарат в пламя.

Фиксация мазка. Для этого используют физический и химический методы. Физический метод заключается в фиксации мазка над пламенем спиртовки в течение нескольких секунд мазком вверх (троекратно по 1 секунде). Эту операцию проводят достаточно быстро, стараясь не перегреть мазок, так как при перегревании могут произойти изменения морфологии клетки. Химический метод фиксации является более мягким по сравнению с фиксацией на пламени. В качестве фиксаторов используют этанол, ацетон, смесь Никифорова (эквивалентное соотношение этанола и эфира). метанол, формалин. После фиксации мазок можно окрашивать.

Окраска мазка. Для окраски мазка следуют предписаниям для каждой методики окраски. При окраске простым способом на мазок наносят несколько капель раствора красителя так, чтобы весь мазок был покрыт им. Краситель оставляют на определенное время. Затем препарат промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой.

Исследование микроорганизмов в живом состоянии

Исследование микроорганизмов в живом состоянии применя­ется главным образом для изучения формы и подвижности бакте­рий, реже при реакции агглютинации. Для этих целей готовят препараты “раздавленная капля” и “висячая капля” (рис. 5).

Препарат “раздавленная капля”. При приготовлении «раздавленной» капли жидкость с исследуемым материалом наносят на пред­метное стекло и сверху накладывают покровное. Капли мате­риала надо брать такой величины, чтобы они заполняли все пространство между покровным и предметным стеклом и не вы­ступали за края покровного.

Препарат “висячая капля”. Для "висячей" капли необходимо иметь предметное стекло с луночкой. На покровное стекло предварительно наносят каплю жидкости с исследуемой культурой микроорганизмов. Затем на по­кровное стекло накладывают предметное стекло, с луночкой посередине, края которой предварительно смазаны вазелином. Предметное стекло слегка прижимают к покровному, в резуль­тате чего оба стекла склеиваются. После этого препарат пере­вертывают покровным стеклом кверху. Получается герметически закрытая камера, в которой капля долго не высыхает.

Простой метод окраски. Является одноэтапным и заключается в окраске микропрепарата одним красителем. Используют основные анилиновые красители, такие как, фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий в виде водных растворов или пропитанных красителем фильтровальных бумажек, которые помещают на мазок и смачивают водой. Продолжительность окраски составляет 3-5 минут, после чего микропрепарат промывают водой, высушивают и микроскопируют. В препаратах, окрашенных простым методом, можно получить представление о форме, расположении и размерах микробных клеток.

Сложные методы окраски. Сложные (дифференцирующие) методы окраски (по Граму, Цилю-Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и дополнительных способов обработки препаратов. Эти методы позволяют дифференцировать бактерии в зависимости от строения их структур, чаще всего поверхностных. Например, метод окраски по Граму позволяет дифференцировать бактерии по строению их клеточной стенки: грамположительные (фиолетовые) с толстой и грамотрицательные (красные) бактерии с тонкой клеточной стенкой.

Существуют специальные сложные методы окраски, которые используют для выявления структурных компонентов бактериальной клетки: капсул, цитоплазматических включений, спор, жгутиков.

Техника окраски по Граму в модификации Синёва.

1. На фиксированный препарат наносят 2-3 капли воды и кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанной генцианвиолет. Окрашивают 1-2 минуты.

2. Снимают бумажку, сливают краску и, не промывая водой, наливают на препарат раствор Люголя на 1 минуту.

3. Сливают раствор Люголя и наливают на препарат спирт с йодом на 30 секунд. Промывают водой.

4. После этого окрашивают мазок водным фуксином в течение 1 минуты.

5. Промывают водой, высушивают препарат фильтровальной бумагой, микроскопируют. В результате окраски грам+ микробы окрашиваются в фиолетовый цвет, грам- в красный.

Окраска по Цилю-Нильсену.

1. На фиксированный препарат помещают полоску фильтровальной бумаги, наливают карболовый фуксин Циля и осторожно нагревают на горелке до появления пара, не допуская кипения жидкости. Нагревание повторяют 3 раза.

2. Снимают бумагу, промывают водой.

3. Погружают 3 раза в 5% раствор серной кислоты.

4. Промывают препарат водой и докрашивают метиленовой синью 5 минут.

5. Промывают водой, высушивают препарат фильтровальной бумагой, микроскопируют.

34. Исследование дистиллированной воды, используемой для приготовления инъекционных растворов и глазных капель: отбор проб, методика исследования, предельно допустимые показатели. Пирогенность воды – определение понятия, природа пирогенности, методика определения пирогенности.

2. Дистиллированная вода для растворов и глазных капель. Инъекционные растворы до стерилизации. Глазные капли, приготовленные в асептических условиях на стерильных основах.

Пробы дистиллированной воды отбирают в стерильные флаконы в количестве 15-20 мл. Инъекционные растворы (до стерилизации) отбирают во время их приготовления, но не позднее 1,5 часов, и доставляют в лабораторию в тех же флаконах, в которых они будут подвергнуты стерилизации. Глазные капли доставляют в аптечной упаковке.

Определение количества мезофильных аэробов и факультативных анаэробов проводят так же, как в предыдущем исследовании.

Определение наличия БГКП в 1 мл проводится следующим образом. Исследуемый материал в количествe 1 мл засевают в 9 мл разведённой среды Эйкмана. Посевы выращивают при 37°С в течение суток, затем высевают на среду Эндо и после суточного инкубирования чашек при 37°С отбирают на чашках подозрительные колонии бактерий и определяют их принадлежность к БГКП.

Количественное определение БГКП проводится следующим образом. 1 мл исследуемого материала наливают в стерильную чашку Петри и заливают растопленной средой Эндо. После застывания среды её инкубируют при 37°С в течение суток и учитывают количество типичных колоний.

Предельно допустимые количества микроорганизмов в 1 мл: дистиллированная вода, используемая сразу же после перегонки, не более 15, не более 3, растворы для инъекций до стерилизации не позднее 1,5 часов после изготовления не более 30.

Наличие кишечной палочки, золотистого стафилококка, синегнойной палочки и протея в данной группе исследуемых материалов недопустимо. глазные капли после стерилизации.

Начало формы

Конец формы

Пирогенность воды –

Источники и природа пирогенных веществ

Различают эндогенные и экзогенные пирогены. Первые являются клеточно-тканевыми продуктами, образующимися в определенных условиях. Вторые - это вещества, содержащиеся в микробах и выделяющиеся в процессе их жизнедеятельности.

Испытание на пирогенность проводится путем введения кроликам (3) в краевую вену уха воды или лекарственного средства с измерением ректальной температуры 3 раза с интервалом 1 час. При этом строго соблюдаются условия, повышения температуры тела кроликов от исключающие возможность повышения температуры тела кроликов от случайных причин.

Воду или раствор лекарственного вещества считают непирогенным, если после введения ни у одного из 3 подопытных кроликов ни при одном из трёх измерений не наблюдалось повышение температуры более чем на 0,6°С по сравнению с исходной температурой и в сумме повышение температуры у 3 кроликов не превышало 1,4°С. Если у одного или 2 кроликов температура повысилась более чем на 0,6°С и в сумме у 3 кроликов повышение температуры составляет более 1,4°С, испытание повторяют дополнительно на 5 кроликах; воду или раствор считают непирогенными, если сумма повышений температуры у всех 8 кроликов не превышает 3,7"С, а повышение температуры на 0,6°С.

56. Возбудители бактериальной дизентерии. Названия возбудителей по латыни, морфология, питательные среды для культивирования. Роль в патологии человека. Материалы для исследования и методы лабораторной диагностики, препараты для специфической профилактики и лечения.

Возбудителями дизентерии (шигеллеза) являются несколько видов бактерий, объединенных в род Shigella. Одного из них впервые обнаружил в 1891 г. русский врач А. Григорьев и изучил во время эпидемии в Японии в 1898 г. Шига. Впоследствии были выделены и описаны другие виды шигелл. По современной классификации к роду Shigella относятся 4 группы, соответственно 4 вида, все виды, кроме S. sonnei, разделены на серовары, S. flexneri - еще на подсеровары.

С-во: Enterobacteriaceae

Род: Shigella

Вид: Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii,  Shigella sonnei

МЕЖДУНАРОДНАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ ШИГЕЛЛ

Группа	Вид	Серовар		Подсеровар
A	Shigella dysenteriae	1	10
B	Shigella flexneri	1 2 3 4 5 x-вар y-вар		1a 1b 2a 2b 3a 3b 4a 4b 5a 5b
C	Shigella boydii	1	15
D	Shigella sonnei

В последние десятилетия дизентерию чаще всего вызывают шигеллы Флекснера и Зонне, реже шигеллы Бойда. S. dysenteriae (Григорьева-Шига) в России не встречается.

Морфология, культуральные, биохимические свойства. Шигеллы представляют собой короткие грамотрицательные палочки, они не образуют спор и капсул, в отличие от сальмонелл не имеют жгутиков.

Факультативные анаэробы. Растут на простых питательных средах, оптимум температуры 37^оС, рН 6,8-7,2.  Для выделения из организма используют среды, содержащие лактозу и желчные кислоты (среда Плоскирева) – бесцветные колонии, а также селенитовый бульон (как среда обогащения).

По биохимическим свойствам различаются/ Сбраживают глюкозу только до кислоты, лактозу в первые сутки не ферментируют (Shigella sonnei  - через несколько суток), маннит ферментируют все виды, кроме S. dysenteriae. Не образуют сероводород.

Антигены. Шигеллы содержат О-антигены, Shigella sonnei          имеют К-антиген. Среди О-антигенов есть специфические и групповые.

Токсинообразование. Экзотоксин, обладающий нейротропным действием, продуцируют S. dysenteriae, и этот вид вызывает заболевание в наиболее тяжелой форме. Все шигеллы содержат термостабильный эндотоксин, защищающий бактерии в желчи от гибели. S. dysenteriae серовара 1 продуцирует шига-токсин

Факторы патогенности. Инвазируют слизистую оболочку толстой кишки с последующим межклеточным распространением. Эта способность связана с функционированием крупной плазмиды инвазии, которая детерминирует синтез белков-инвазинов. Эти белки чувствительны к трипсину, поэтому процесс инвазии начинается именно в толстой кишке. Межклеточное распространение связано с «белком распространения», который вызывает лизис мембран эукариотической клетки. Также шигеллы продуцируют белковый цитотоксин, который поражает эндотелий, следствием чего является появление в кале крови.

Устойчивость. Наиболее устойчивы во внешней среде S. sonnei, наиболее НЕ устойчивы - S. dysenteriae. Кипячение убивает шигеллы немедленно, при 60^оС они гибнут через 10-20 минут, но встречаются термоустойчивые S. sonnei, погибающие только при 70^оС в течение 10 минут, то есть способные выжить при пастеризации молока. В воде, почве, в пищевых продуктах, на предметах, в посуде шигеллы сохраняются жизнеспособными в течение одной-двух недель. S. sonnei могут размножаться в молоке. В кишечнике мух и на их лапках шигеллы выживают в течение 2-3 дней. Перелетая с нечистот и отбросов на пищевые продукты, мухи могут переносить возбудителей. Быстро погибают под действием прямых солнечных лучей и под действием дезинфицирующих средств.

В то же время шигеллы очень нестойки в пробах фекалий, так как погибают под влиянием микробов-антагонистов и кислой реакции среды. Поэтому пробы, взятые для исследования, надо сразу же засевать на питательную среду.

Заболевание у человека. Болеет только человек. Источником инфекции является человек - больной или носитель. Механизм передачи фекально-оральный.  Пути передачи: пищевой (чаще всего с молочными продуктами), водный, контактно-бытовой. Заражение происходит через рот. Инкубационный период длится от 2 до 7 дней.

Возбудитель проникает в клетки эпителия слизистой оболочки толстой кишки и размножается в них. Это приводит к воспалению (колиту) и образованию язв. Основные симптомы: повышение температуры тела, боли внизу живота, рвота, частый стул, в тяжелых случаях примесь в стуле слизи и крови; характерный признак - тенезмы (ложные болезненные позывы). После гибели шигелл происходит выделение токсинов, действие который обуславливает появление крови в испражнениях. Бактериемия не наблюдается. В случае шигеллеза, вызванного S. dysenteriae серовара 1 токсин попадает в кровь, вызывает поражение гломерул почки и приводят к почечной недостаточности.  Болезнь длится 8-10 дней. Больные с легкими формами заболевания часто не обращаются за квалифицированной помощью, занимаясь самолечением. Недолеченная дизентерия может переходить в хроническую форму.

Иммунитет. После перенесенного заболевания иммунитет нестойкий. Во время заболевания образуются антитела, обнаружение которых имеет диагностическое значение.

Микробиологическая диагностика. Материалом для бактериологического исследования являются испражнения (faeces). Пробу следует брать до начала антибактериальной терапии, лучше всего с помощью ректальных трубок, посев производить сразу же или помещать пробу в консервирующую жидкость (30% глицерина и 70% буферного раствора) не более чем на один день. Для посева отбирать комочки слизи. Количество шигелл в пробе может быть очень скуд-ным, поэтому посев производится на элективную  среду  Плоскирева или на среду обогащения - селенитовую.

Выделенную чистую культуру идентифицируют по морфологии, биохимическим свойствам и в реакции аглютинации с адсорбированными видовыми сыворотками. Определяют чувствительность к антибиотикам. Шигеллы относятся к числу бактерий, быстро приобретающих устойчивость к антибиотикам, в большинстве случаев связанную с R-плазмидами.

С целью диагностики используют серологические реакции: агглютинации, РНГА. Антитела появляются на второй-третьей неделе заболевания.

Лечебные препараты. Специфическая профилактика не разработана. В очагах заболеваемости используют дизентерийный бактериофаг.

Лечение антибиотиками следует проводить с учетом чувствительности к ним возбудителей. Применяют левомицетин, тетрациклин; эффективны нитрофурановые препараты, поливалентный бактериофаг. При хронической дизентерии применяют вакцинотерапию с помощью химической вакцины, вводимой через рот.

78. Возбудитель полиомиелита: таксономическое положение, структура, серологические типы, источники и механизмы заражения, материалы для исследования и методы лабораторной диагностики, препараты для специфической профилактики.

Таксономия.: семейство Picornaviridae, род Enterovims, вид Poliovirus.

Структура. По структуре полиовирусы — ти­пичные представители рода Enterovirus. РНК-содержащие вирусы.

Морфология: мелкие, просто организованные вирусы, сферической формы, состоят из одноцепочечной РНК и капсида.

Культивирование: Хорошо репродуцируются в первичных и перевариваемых культурах клеток из тканей человека и сопровождается цитопатическим эффектом. В культуре клеток под агаровым покрытием энтеровирусы образуют бляшки.

Антигенные свойства: Различают 3 серотипа внутри вида: 1, 2, 3, не вызывающие перекрес­тного иммунитета. Все серотипы патогенны дл человека.

Патогенез и клиника. Естественная воспри­имчивость человека к вирусам полиомиелита высокая. Входными воротами служат слизис­тые оболочки верхних дыхательных путей и пищеварительного тракта. Первичная репро­дукция вирусов происходит в лимфатических узлах глоточного кольца и тонкой кишки. Из лимфа­тической системы вирусы проникают в кровь, а затем в ЦНС, где избирательно поражают клетки передних рогов спинного мозга (двигательные нейроны). Инкубационный период продолжается в среднем 7—14 дней. Различают 3 клинические формы полиомиелита: паралитическую, менингеальную (без параличей), абортивную (легкая форма). Заболевание на­чинается с повышения температуры тела, об­щего недомогания, головных болей, рвоты, болей в горле.

Иммунитет. После перенесенной болезни остается пожизненный типоспецифический иммунитет. Иммунитет определяется наличием вируснейтрализующих ан­тител, среди которых важная роль принадле­жит местным секреторным антителам слизис­той оболочки глотки и кишечника (местный иммунитет). Пассивный ес­тественный иммунитет сохраняется в течение 3—5 недель после рождения ребенка.

Микробиологическая диагностика. Материал для исследования - кал, отделяемое носог­лотки, при летальных исходах — кусочки го­ловного и спинного мозга, лимфатические узлы.

Вирусы полиомиелита выделяют путем за­ражения исследуемым материалом первичных и перевиваемых культур клеток. О реп­родукции вирусов судят по цитопатическому действию. Идентифицируют вы­деленный вирус с помощью типоспецифических сывороток в реакции нейтрализации в культуре клеток. Важное значение имеет внутривидовая дифференциация вирусов, ко­торая позволяет отличить патоген­ные штаммы от вакцинных штаммов, выделя­ющихся от людей, иммунизированных живой полиомиелитной вакциной. Различия между штаммами выявляют с помощью ИФА, реакции нейтрализации цитопатического действия вируса в культуре клеток со штаммоспецифической иммунной сывороткой, а также в ПЦР.

Серодиагностика основана на использова­нии парных сывороток больных с примене­нием эталонных штаммов вируса в качестве диагностикума. Содержание сывороточных иммуноглобулинов классов IgG, IgA, IgM оп­ределяют методом радиальной иммунодиффузии по Манчини.

Лечение. Патогенетическое. Применение гомологичного иммуноглобулина для пре­дупреждения развития паралитических форм ограничено.

Профилак­тика. Основной мерой профилактики полиомиелита является иммунизация. Первая инактивированная вакцина для профилактики – создавала общий гуморальный иммунитет, не формировала местной резистентности слизистых оболочек ЖКТ, не обеспечивала надежную защиту.

Пероральная живая культуральная вакцина из трех серотипов штаммов. Используют для массовой иммунизации детей, она создает стойкий общий и местный иммунитет.

Неспецифическая профилактика сводится к санитарно-гигиеническим мероприятиям.