Реакция иммунофлуоресценции (прямая и непрямая). Механизм. Использование в диагностике.
Ответ.
Реакция иммунофлуоресценции – РИФ.
Данный метод является экспрессным и высокочувствительным. Существуют две его разновидности.
При прямом методе (ПИФ – сероиндикация, экспресс-диагностика) к исследуемой взвеси микробов (АГ), фиксированной на стекле, добавляют сыворотку, меченную флуорохромом (АТ, меченную ФИТЦ). То есть НЕПОСРЕДСТВЕННОЕ взаимодействие АГ со специфическими АТ (из диагностических сывороток), мечеными флуоресцентным красителем (ФИТЦ – флюоресцеина изотиоцианат).
Образующийся комплекс антиген-антитело при освещении ультрафиолетовыми (сине-фиолетовыми) лучами дает ярко-зеленое свечение.
Непрямая РИФ (нРИФ, РНИФ – серодиагностика) проводится с целью установления титра антител в исследуемой сыворотке крови. Для этого исследуемую сыворотку в разных разведениях наносят на предварительно приготовленные мазки из агаровой культуры микроба. Несвязавшиеся антитела отмывают, а препараты докрашивают антивидовой люминесцирующей сывороткой. Под люминесцентным микроскопом устанавливают титр антител.
.
Рис. Реакция иммунофлюоресценции (схема).
Прямая РИФ |
Непрямая РИФ |
|
|
Следовательно, применение РИФ в медицинской практике следующее:
сероиндикация (ПИФ);
серодиагностика (нРИФ).
Реакция нейтрализации. Принцип. Механизм. Использование в микробиологии при бактериальных и вирусных инфекциях.
Ответ.
В основе этой реакции лежит способность специфических антител нейтрализовать токсическое действие антигена.
Роль антигена может выполнять микробный экзотоксин. В этом случае обезвреживание токсина в ходе физико-химической реакции нейтрализации происходит за счет связывания его свободных аминогрупп, что приводит к потере токсичности.
Для проведения реакции исследуемый материал, в котором предполагается наличие экзотоксина, смешивают с антитоксической сывороткой, выдерживают в термостате и вводят животным (морским свинкам, мышам). Контрольным животным вводят фильтрат исследуемого материала, не обработанный сывороткой. В том случае, если произойдет нейтрализация экзотоксина антитоксической сывороткой, животные опытной группы останутся живыми. Контрольные животные погибнут в результате действия экзотоксина.
Если антиген – вирусный материал, антитела нейтрализуют инфекционное и цитопатическое действие вирусов в чувствительных к вирусу живых системах.
Реакция нейтрализации инфекционного и цитопатического действия вирусов воспроизводится в чувствительных к вирусу живых системах. Из материала, содержащего вирус, готовят серийные разведения и добавляют к ним специфическую сыворотку в разведении в соответствии с титром, указанным в инструкции. Смесь инкубируют 30-60 минут при температуре 37 С, после чего заражают ею культуру ткани, куриные эмбрионы или лабораторных животных. Контролем служит чувствительная система, зараженная вирусом обработанным нормальной сывороткой.
Положительной считают РН при отсутствии ЦПД в культуре клеток, изменений в куриных эмбрионах, а также заболевания или гибели животных. На основании результатов РН определяют индекс нейтрализации – отношение титра вируса в контроле к титру вируса в опыте. Если индекс нейтрализации менее 10 – реакция отрицательная, от 11 до 49 – сомнительная, от 50 и выше – положительная (достоверное соответствие вируса антисыворотке).
Наиболее чувствительным вариантом РН является подавление вирусного бляшкообразования под действием вирусспецифической антисыворотки (реакция редукции вирусных бляшек). РН позволяет определить видовую и типовую принадлежность вируса.
Реакция нейтрализации вирусов в культуре клеток: А – цитопатогенный эффект (ЦПЭ) в результате размножения вирусов; Б - ЦПЭ отсутствует в результате нейтрализации вирусов антителами (т.е. антисыворотка соответствует антигену). |
|
