16. Реакция агглютинации, ее разновидности (ориентировочная, непрямая, развернутая). Механизм. Практическое применение.

Ответ.

Реакция агглютинации (РА) одна из первых иммунологических реакций, которую применяют в микробиологической практике. Впервые (1895) РА для диагностики брюшного тифа применил Ф. Видаль. Позже (1897) эту же реакцию для диагностики бруцеллеза у людей использовал А. Райт. РА нашла применение также при диагностике пуллороза цыплят, лептоспироза, инфекционного аборта кобыл, а также для типизации неизвестных культур микробов по заведомоизвестной агглютинирующей сыворотке. РА высокочувствительна; с ее помощью можно выявить 0,01 мкг азота белка антител в 1 мл.

Реакция агглютинации (РА) (от лат. agglutinatio, склеивание) позволяет выявить корпускулярные АГ, точнее АГ, локализованные на поверхности сравнительно крупных частиц (микроорганизмы, клетки различного происхождения).

Механизм РА описывает «теория решётки», согласно которой двухвалентное AT взаимодействует одним активным центром с детерминантой одной молекулы АГ, а другим – с детерминантой второй молекулы АГ. В результате подобного взаимодействия образуется агглютинат. Его формирование невозможно при дефиците или избытке AT. Реакция агглютинации проявляется склеиванием корпускулярных АГ под воздействием AT (агглютининов) и реализуется в изотоническом растворе электролита, например 0,9% раствора NaCl. В реакции агглютинации также можно определять и содержание AT в сыворотке крови больных, например, брюшным тифом (реакция Видаля) или бруцеллёзом (реакция Райта).

РА бывает:

1) ориентировочной (пластинчатой, на стекле) (сероидентификация возбудителя (определение серотипа м/о, серотипирование) / качественная серодиагностика (определение наличия АТ) бруцеллёза – реакция Хеддельсона).

НАПРАВЛЕНИЕ – сероидентификация (серотипирование).

Постановка. На обезжиренное предметное стекло наносят раздельно каплю известной агглютинирующей сыворотки, например сальмонелиозной, и каплю физиологического раствора (контроль). Затем бактериологической петлей берут бактериальную массу изучаемой культуры из колонии в чашке Петри или с поверхности скошенного МПА в пробирке и суспендируют раздельно в иммунной сыворотке и физиологическом растворе до получения гомогенной взвеси. Результат учитывают через 2…4 мин.

Учет. В контрольной пробе изменения должны отсутствовать. При специфическом соответствии культуры бактерий иммунной сыворотке появляются хлопья агглютината (положительный результат), в случае отсутствия феномена агглютинации делают заключение о том, что исследуемая культура бактерий не соответствует иммунной сыворотке.

НАПРАВЛЕНИЕ – КАЧЕСТВЕННАЯ серодиагностика бруцеллёза (реакция Хеддельсона)

Сущность метода заключается в выявлении специфических антител в сыворотке крови животных, основанном на способности антител сыворотки агглютинировать бруцеллезный антиген, результатом чего является формирование выраженной агглютинации окрашенных бруцелл антигена в виде крупных или мелких хлопьев розового цвета (КАЧЕСТВЕННАЯ, т.к. титр не определяем, определяем, есть ли вообще антитела).

Следовательно, применение ориентировочной РА в медицинской практике следующее:

• сероидентификация;

• серодиагностика качественная.

РА бывает:

2) развернутой (пробирочной) (количественная серодиагностика (определение количества АТ в сыворотке больного) / сероидентификация (определение серотипа м/о– если определить м/о не удалось):

НАПРАВЛЕНИЕ – серодиагностика.

Схема постановки пробирочной РА для обнаружения антител в сыворотке крови.

Постановка.

Компонент реакции	Количество компонента (мл) в пробирке
	1-й (исходное разведение и контроль антигена)	2-й	3-й	4-й	5-й	6-й (контроль антигена)
Физиологический раствор	2,4	–	0,5	0,5	0,5	0,5
Исследуемая сыворотка крови	0,1	0,5 из 1-й проб.	0,5 из 1-й проб.	Последовательный перенос по 0,5 начиная с 3-й проб.		–
Полученное разведение	1 : 25	1 : 25	1 : 50	1 : 100	1 : 200
Бруцеллезный антиген, 109кл/мл	–	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Конечное разведение	1 : 25	1 : 50	1 : 100	1 : 200	1 : 400
	Премешивают встряхиванием. Инкубирование при 37…38 оС 18…20 ч

Из 5-1 пробирки удаляют 0,5 мл жидкости перед добавлением антигена.

Одновременно по аналогичной схеме исследуют заведомо положительную и отрицательную сыворотки (положительный и отрицательный контроли).

Учет результатов начинают с контрольных пробирок – не должно быть спонтанной (неспецифической) агглютинации в 6-й пробирке (контроль антигена) и хлопьев осадка в 1-й пробирке (контроль сыворотки). В остальных пробирках наличие и интенсивнось агглютинации учитывают визуально и оценивают в крестах: 1) (+ + + +) – полная агглютинация – хорошо выраженный осадок и полное просветление жидкости (агглютинировало 100% антигена); 2) (+ + +) – неполная аглютинация с хорошо выраженным осадком и со слабой опалесценцией жидкости (агглютинировало 75% антигена); 3) (+ +) – частичная агглютинация с небольшим осадком, надосадочная жидкость мутная (агглютинировало 50% антигена); 4) (+)– очень небольшой осадок, жидкость непрозрачная (агглютинировало 25% антигена); 5) (–)– отсутсвие агглютинации, осадка нет, жидкость мутная.

За положительный результат принимают агглютинацию минимум на два креста. Максимальное разведение исследуемой сыворотки крови, обеспечивающее агглютинацию минимум на два креста или более, называют титром сыворотки. Титр сыворотки отражает количественное содержание антитела крови исследуемого животного.

Табл. Учет результатов РА для обнаружения антител в сыворотке крови

Сыворотка крови	Номера пробирок (разведение сыворотки)
	1 (контроль сыворотки)	2 (1 : 50)	3 (1 : 100)	4 (1 : 200)	5 (1 : 400)	6 (контроль антигена)
Исследуемая	–	+ + + +	+ + + +	+ + +	+	–
Положительная (контроль)	–	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + +	–
Отрицательная (контроль)	–	–	–	–	–	–

НАПРАВЛЕНИЕ – сероидентификация.

Для идентификации м/о используют пробирочную РА, если из-за антигенного родства с различными видами или внутривидовыми сероварами в РА на стекле микроорганизм определить не удалось. Например, если культура E. coli дает в РА на стекле положительный результат одновременно с иммунными сыворотками против нескольких О-серогрупп, ее испытывают как антиген с теми же сыворотками уже в пробирочной РА и относят к той О-серогруппе, с сывороткой которой она дает максимальные титры.

Следовательно, применение развернутой РА в медицинской практике следующее:

• серодиагностика количественная;

• сероидентификация.