инфекция и иммунитет / Реакции РА (практическая часть)
.pdfПРИГОТОВЛЕНИЕ ИММУННЫХ СЫВОРОТОК. РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ (РА) В ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕИЗВЕСТНОГО МИКРОБА ПО ИЗВЕСТНОЙ СЫВОРОТКЕ. РА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В ИССЛЕДУЕМОЙ СЫВОРОТКЕ ПО ИЗВЕСТНЫМ ДИАГНОСТИКУМАМ. РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ. ФАГОЦИТОЗ. ВЛИЯНИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ НА ИНФЕКЦИЮ И ИММУНИТЕТ.
Практическая часть
Реакция агглютинации (agglutinacio – склеивание) – склеивание корпускулярных антигенов (микроорганизмов, эритроцитов и др. клеток) под действием специфических антител в присутствии электролита, что проявляется образованием осадка в виде хлопьев или зерен.
Реакция протекает в две фазы. В первой фазе происходит специфическое присоединение антител к поверхности клетки, во второй – образование агглютината и выпадение его в осадок в присутствии электролита. Видимая реакция происходит в том случае, если антитела имеют два активных центра, к каждому из них присоединяется антиген, и в результате образуется «решетка».
Для постановки РА необходимы три компонента:
1)антиген (агглютиноген),
2)антитело (агглютинин),
3)электролит (физраствор).
Кроме специфической агглютинации возможны спонтанная (дают R-формы бактерий) и «кислотная» неспецифические агглютинации. Чтобы их исключить всегда ставят контроль антигена (КА) с взвесью используемых в РА микробов в физиологическом растворе. Учет реакции производят, начиная с контролей. В КА должно быть равномерное помутнение (исключается неспецифическая аггютинация), в контроле сыворотки (КС) – прозрачная жидкость.
Получение диагностических агглютинирующих сывороток
Групповую, видовую и типовую принадлежность неизвестного микроба определяют при помощи диагностической агглютинирующей сыворотки. Для получения агглютинирующих сывороток проводят многократную (5-7 раз) иммунизацию лабораторных животных, чаще кроликов, убитыми или живыми, но ослабленными микроорганизмами. Антигены (взвесь микробов) сначала вводят подкожно, а при последующих инъекциях – внутривенно в возрастающих дозах с интервалами в 3-5 дней. Через 7 дней после окончания иммунизации делают пробное кровопускание. Для этого из уха или сердца кролика берут кровь, помещают её в термостат при 37°С на 1015 минут. После свертывания крови сгусток отслаивают от стенок пробирки стеклянной палочкой и выдерживают при 4°С в течение часа для лучшей ретракции сгустка.Полученную сыворотку осторожно отсасывают пипеткой, переносят в стерильную пробирку и титруют. Последовательность этапов постановки РА для определения титра агглютинирующей сыворотки:
1)разлить физ. раствор по 1 мл во все пробирки, кроме первой и последней;
2)развести сыворотку 1/100;
3)разлить сыворотку в разведении 1/100 в первую, вторую и последнюю пробирки по 1 мл;
4)начиная со 2-ой пробирки, переносить сыворотку по 1,0 мл во все пробирки, кроме двух последних;
5)закапать во все пробирки взвесь брюшнотифозных микроорганизмов по 0,1 мл;
6)поставить на 2 часа в термостат при температуре 37°С;
7)оставить при комнатной температуре на 18-20 часов;
8)учесть реакцию.
Если титр высокий, то делается массивное кровопускание. Из крови готовится сыворотка, определяется её титр. Сыворотка разливается по ампулам и маркируется.
Титром агглютинирующей сыворотки называется максимальное её разведение, в котором наблюдается агглютинация гомологичного микроба.
Схема реакции агглютинации для определения титра агглютинирующей сыворотки
Пример. Произведен учет РА в пробирках, поставленной для определения титра агглютинирующей сыворотки. В контроле сыворотки (КС) – прозрачная жидкость. В контроле антигена (КА) – равномерное помутнение, что исключает неспецифическую агглютинацию. В опытных пробирках РА наблюдается во всех разведениях сыворотки от 1/100 до 1/6400. В разведении 1/12800 – равномерное помутнение. Следовательно, в поставленной РА титр агглютинирующей сыворотки равен 1:6400.
Полученные таким образом сыворотки называются неадсорбированными, поскольку содержат групповые агглютинины и могут в небольших разведениях склеивать родственные по антигенам бактерии.
Методы постановки РА:
1)РА на предметном стекле в капле сыворотки, разведенной 1:10 (ориентировочная), наступает в течение нескольких минут;
2)РА развернутая в пробирках с последовательными разведениями сыворотки. РА применяют:
1)для сероидентификации неизвестного микроба.
2)для серодиагностики инфекционных заболеваний, т.е. для определения специфических антител;
Постановка РА на стекле (ориентировочная) для определения неизвестного микроба
На предметное стекло наносят на достаточном расстоянии друг от друга три капли: физ.раствора, и, например, каплю брюшнотифозной и каплю паратифозной агглютинирующих сывороток в небольших разведениях (1:10). Культуру неизвестного микроба с помощью бактериальной петли вносят в каждую каплю, начиная с физ.раствора, и тщательно размешивают до получения равномерной взвеси. Петлю после каждого внесения исследуемого микроба необходимо стерилизовать в пламени спиртовки. Реакция протекает быстро. Учет производят через 2-3 минуты:
в капле физраствора (контроль) – равномерное помутнение, положительная РА–появление зерен и хлопьев агглютината, отрицательная РА – помутнение, как в контроле.
Пример.
Поставлена ориентировочная РА на стекле для определения вида неизвестного микроба с брюшнотифозной (б/т) и паратифозной В (п/т В) агглютинирующими сыворотками (разведение 1:10). Реакция положительная с б/т сывороткой и отрицательная п/т В сывороткой, следовательно, неизвестный микроб по антигенным свойствам соответствует культуре брюшнотифозной палочки.
Для более точной сероидентификации неизвестного микроба ставят развернутую реакцию с сывороткой, вызвавшей агглютинацию, до её титра. Вид микроба или его серовар определяется по сыворотке, если агглютинация наблюдается до титра диагностической сыворотки или в разведении близком ему.
Пример. Произведен учет развернутой РА, поставленной для определения неизвестного микроба с брюшнотифозной (б/т) и паратифозной В (п/т В) агглютинирующими сыворотками до их титра. Реакция положительная с б/т сывороткой и отрицательная с п/т В сывороткой до титра сывороток, следовательно, неизвестный микроб окончательно идентифицирован по антигенным свойствам и соответствует возбудителю брюшного тифа.
Схема постановки реакции агглютинации для определения неизвестного микроба по известной сыворотке
Взависимости от свойств АГ внешнее проявление положительной РА бывает различным. Мелкозернистую О-агглютинацию дают бактерии, лишенные жгутиков; она протекает медленно,
втечение 18-20 часов. Крупнохлопчатая Н-агглютинация наблюдается у бактерий, имеющих жгутики. Она протекает быстрее, в течение 2-4 часов.
Более достоверные результаты при сероидентификации бактерий дают адсорбированные (монорецепторные) сыворотки, лишенные групповых агглютининов, вследствие чего нет необходимости разводить их. РА с такими сыворотками ставят на предметном стекле.
РА широко используют для диагностики многих инфекционных заболеваний: брюшного тифа и паратифов, сыпного тифа, бруцеллеза, туляремии, эшерихиозов, сальмонеллезов, дизентерии, холеры, чумы, коклюша и др.
Вответ на введение антигена в организме возникает иммунный ответ, который выражается
ввыработке специфических антител.
Антитела – это иммуноглобулины, вырабатываемые в ответ на введение антигена и способные специфически с ним связываться.
Выявление специфических антимикробных антител широко используют в серодиагностике инфекционных заболеваний. Для этого со 2 недели заболевания ставят РА с исследуемой сывороткой и микробными (корпускулярными) диагностикумами.
Диагностикум – взвесь микроорганизмов, убитых нагреванием или химически, и стандартизированных по микробному стандарту мутности до густоты 2 млрд. микробных тел в 1 мл.
Постановка развернутой РА
Кровь в количестве 3-4 мл берут натощак, отделяют сыворотку. Сначала готовят в физ. растворе основное разведение сыворотки, из которого делают серию последовательных двукратных разведений (схема). В каждую пробирку вносят по 2 капли взвеси бактерий в физ. растворе (диагностикум). Реакцию сопровождают контролем антигена (диагностикум) и сыворотки (исследуемая сыворотка в первом разведении). Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре 37°С на 2 часа, затем сутки выдерживают при комнатной температуре.
Учет развернутой РА.
В контрольных пробирках агглютинации не должно быть.
Положительная РА – образование осадка в виде хлопьев или зерен, что свидетельствует о наличие специфических антител в исследуемой сыворотке.
Отрицательная РА – помутнение, как в контроле антигена (отсутствие специфических антител).
Титром сыворотки является последнее её разведение, в котором наблюдается видимая агглютинация.
Критерием заболевания служит диагностический титр, заранее отработанный для всех заболеваний, при которых используется серологический метод. Например, диагноз брюшного тифа подтверждается, если титр специфических антител в исследуемой сыворотке, равен или выше 1:200.
В сомнительных случаях критерием является нарастание титра специфических антител в течение болезни. Для этого РА ставят с сывороткой больного, взятой через 1-2 недели.
Схема постановки реакции агглютинации для определения антител в сыворотке больного
Пример. Произведен учет развернутой РА, поставленной для выявления специфических антител в сыворотке больного при подозрении на брюшной тиф. Реакция положительная с брюшнотифозным диагностикумом (б/т) и отрицательная с паратифозным В диагностикумом (п/т В). Следовательно, в сыворотке обнаружены брюшнотифозные антитела, их титр равен 1:400. Паратифозных антител не выявлено. Поскольку титр специфических антител превышает диагностический, диагноз заболевания брюшным тифом подтверждается.
Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА, РПГА)
Применяется при работе с растворимыми, мелкодисперсными антигенами. В реакции используются стандартные эритроцитарные диагностикумы. Их получают производственным способом путем адсорбции на эритроцитах антигенов бактерий (антигенные диагностикумы) или специфических антител (антительные диагностикумы).
Для выявления специфических антител в исследуемой сыворотке используют антигенные эритроцитарные диагностикумы. Реакцию ставят в пластмассовом планшете, в лунках которого готовят последовательные разведения сыворотки больного в объеме 0,5 мл. В каждую лунку вносят одинаковый объем (0,25 мл) эритроцитарного диагностикума. Учитывают через 2 часа инкубации при температуре 37°С и окончательно – через 18-20 часов выдерживания при комнатной температуре.
Для контроля реакции к 0,5 мл физ. раствора добавляют 0,25 мл диагностикума. Положительный результат – кружевной осадок эритроцитов на дне лунки в виде «зонтика»
с неровным краем.
Отрицательный результат – осадок эритроцитов на дне лунки в виде диска – «пуговки». В КА должен быть осадок эритроцитов в виде «пуговки».
Пример. Произведен учет РПГА, поставленной с эритроцитарным Vi-антигенным сальмонеллезным диагностикумом при подозрении на носительство брюшного тифа. Реакция положительная в разведениях исследуемой сыворотки от 1/10 до 1/320 («зонтик») и отрицательная в разведении 1/640 («пуговка»). Следовательно, в сыворотке обнаружены специфические Viантитела, характерные для носителей. Их титр равен 1/320, что превышает диагностическое значение (1/40), диагноз носительства подтверждается.
РНГА более чувствительная и специфичная, чем РА. Её широко применяют в диагностике сыпного тифа и других риккетсиозов, бруцеллеза, туляремии, брюшного тифа, дизентерии, эшерихиозов, туберкулеза и других инфекций.
Фагоцитоз – процесс активного поглощения и переваривания специализированными клетками организма (фагоцитами) микробов и других чужеродных клеток и веществ.
Фагоцитоз, который включает в себя все четыре стадии, называется завершенным. При незавершенном фагоцитозе отсутствует последняя стадия (гонорея, лепра, туберкулез и др.).
Методы оценки функциональной активности фагоцитов
Количественную оценку фагоцитарной активности гранулоцитов и моноцитов проводят с использованием цельной крови и лейкоцитарной взвеси. Фагоцитирующие клетки смешивают с объектами фагоцитоза (частицы латекса, суспензия убитых нагреванием клеток бактерий) в соотношении 1:100 или 1:10. Инкубируют при 370 С 30 минут при постоянном помешивании. Затем взвесь центрифугируют и осадок ресуспендируют в капле сыворотки крови для приготовления мазка.
В мазках, окрашенных по Романовскому, подсчитывают: фагоцитарный показатель – процент фагоцитирующих клеток (норма 40-80%), фагоцитарное число – среднее количество поглощенных частиц на одну клетку (норма - 1-5).
В оценке фагоцитоза используется опсоно-фагоцитарный индекс – отношение фагоцитарных показателей, полученных с иммунной и неимунной сывороткой. Должен быть в норме >1.
Изучено явление незавершенного фагоцитоза в мазке, окрашенном метиленовым синим, из гнойного отделяемого больного гонореей. При микроскопии обнаружены лейкоциты, внутри которых расположены диплококки бобовидной формы. Такие клетки являются фагоцитами и фагоцитоз в них незавершен.
Влияние ионизирующей радиации на инфекцию и иммунитет
Ионизирующая радиация обладает мощным проникающим и повреждающим клеточный геном действием. Облучение животного организма вызывает развитие специфической лучевой болезни. Иммунный статус организма в этих условиях существенно изменяется.
Облучение организма летальными и сублетальными дозами до иммунизации угнетает выработку антител, удлиняются сроки антителообразования, однако полной ингибиции не происходит. Максимальное угнетение наблюдается при иммунизации через 1-2 суток после облучения.
Пример. Изучено формирование приобретенного активного иммунитета в опыте с двумя кроликами. Одного кролика (опыт) за 2 дня до иммунизации облучили сублетальными дозами радиации. Другого кролика (контроль) иммунизировали той же вакциной, но не облучали. После иммунизации уровень специфических антител в сыворотках этих животных определили с помощью развернутой РА. Титр антител у опытного кролика оказался равен 1/50, у контрольного кролика – 1/800. Снижение антителообразования у опытного кролика в 16 раз по сравнению с контрольным свидетельствует о угнетении формирования искусственного активного иммунитета под действием радиации.
РА с сывороткой здорового кролика (контроль)
РА с сывороткой облученного кролика (опыт)