инфекция и иммунитет / Реакции РА (теория)

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ИММУННЫХ СЫВОРОТОК. РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ (РА) В ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕИЗВЕСТНОГО МИКРОБА ПО ИЗВЕСТНОЙ СЫВОРОТКЕ. РА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В ИССЛЕДУЕМОЙ СЫВОРОТКЕ ПО ИЗВЕСТНЫМ ДИАГНОСТИКУМАМ. РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ. ФАГОЦИТОЗ. ВЛИЯНИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ НА ИНФЕКЦИЮ И ИММУНИТЕТ.

Специфические (иммунологические) методы широко применяются в различных областях медицины и биологии. Важную роль они играют в диагностике бактериальных, вирусных, протозойных инфекций. Значительность этих методов возрастает в связи с тем, что многие инфекционные заболевания в последнее время протекают в атипичной форме, и это затрудняет традиционную диагностику.

Велико значение иммунологических методов в выявлении злокачественных новообразований, иммунодефицитных состояний, аллергических и аутоиммунных заболеваний.

Кроме того, классические микробиологические методы при большой их достоверности имеют ряд недостатков: длительность культивирования, трудности выделения и идентификации культуры микроорганизмов. В связи с этим в настоящее время большее распространение получили методы, позволяющие обнаружить возбудитель непосредственно в клиническом материале. К ним относятся иммунологические и молекулярно-генетические индикации патогенов.

Иммунодиагностические реакции

Иммунитет – совокупность биологических явлений (процессов и механизмов), направленных на сохранение гомеостаза и защиту организма от инфекционных и других генетически чужеродных для него агентов.

Реакции иммунитета легли в основу лабораторных методов диагностики инфекционных заболеваний. основанные на специфическом взаимодействии комплементарных по отношению друг к другу компонентов: антигенов (АГ) и антител (АТ) или сенсибилизированных лимфоцитов.

Антигены – это любые генетически чужеродные для данного организма вещества органического происхождения, которые при попадании в организм вызывают ответную специфическую иммунологическую реакцию.

Антигенами являются биополимеры, чаще белки и их комплексные соединения с углеводами (гликопротеиды), липидами (липопротеиды), нуклеиновыми кислотами (нуклеопротеиды). Антигенными свойствами обладают яды растительного и животного происхождения, бактерии и их токсины, вирусы, чужеродные клетки.

Антигены обладают двумя обязательными свойствами – антигенностью и специфичностью. Антигенность – способность антигена индуцировать в организме иммунный ответ, в

частности образование антител.

Специфичность – способность антигена взаимодействовать только с гомологичными антителами.

Антитела (иммуноглобулины) – специфические белки, которые синтезируются клетками лимфоидной ткани под воздействием различных антигенов и способны специфически взаимодействовать с ними.

Специфичность антител обусловлена активными центрами, т.е. участками молекулы иммуноглобулина, которые соединяются с детерминантными группами (эпитонами) антигена. Число активных центров называют валентностью антител.

Различают пять классов иммуноглобулинов (IgG, IgМ, IgА, IgД, IgЕ), которые отличаются по физико-химическим и биологическим функциям.

Синтез антител протекает в две фазы.

Первая – индуктивная, которая длится 3-5 суток от момента введения антигена до появления антител в крови.

Вторая – продуктивная, когда антитела появляются в крови, количество их нарастает к 15-30 суткам и затем снижается.

Иммунный ответ после первого введения антигена называют первичным. Первоначально синтезируются IgМ, затем IgG.

Вторичный иммунный ответ развивается при повторном введении того же антигена. Индуктивная фаза его короче (1-2 суток), уровень антител нарастает быстрее, достигает более высоких значений и сохраняется дольше, медленно снижаясь в течение нескольких лет. При вторичном иммунном ответе с самого начала образуются IgG.

Выявление специфических антимикробных антител широко используют в серодиагностике инфекционных заболеваний. Для этого со 2 недели заболевания ставят РА с исследуемой сывороткой и микробными (корпускулярными) диагностикумами.

Постановка развернутой РА

Специфические антитела появляются в организме человека после перенесенного инфекционного заболевания. Индуцировать антителообразование можно иммунизацией лабораторных животных с целью получения иммунных сывороток, которые используются для диагностики и лечения инфекционных заболеваний.

Вмикробиологической практике нашли широкое применение реакции взаимодействия антигенов с иммунными сыворотками – серологические.

Внешние проявления реакции зависят от свойств антител, антигенов и условий Все методы с использованием иммунологических реакций можно разделить на 2 группы: - реакции in vitro (вне организма)

- реакции in vivo (на пациенте, аллергологические пробы).

Всвою очередь, иммунные реакции in vitro с использованием сыворотки легли в основу серологических методов (от лат. serum – сыворотка и logos – учение), т.е. методов определения антител и антигенов.

Внастоящее время разработаны серологические реакции, с помощью которых антитела можно определять не только в сыворотке крови больных, но и в других биологических жидкостях.

Для серологических реакций характерно:

1) строго специфичное взаимодействие АГ и АТ, они должны подходить друг другу как «ключ – замок»;

2) серологическая реакция происходит при эквивалентных соотношениях количества АГ и

АТ;

3) взаимодействие между АГ и АТ протекает в две фазы:

- специфическую, при которой происходит комплементарное соединение активных центров антител и эпитов антигенов (длится несколько минут);

- неспецифическую, когда наблюдается проявление образования иммунных комплексов (длится от нескольких минут до нескольких часов).

Результатом реакции служит видимое физическое явление, например, образование хлопьев (феномен агглютинации), преципитата в виде помутнения, лизис клеток.

Внешние проявления реакции зависят от свойств антигенов, антител, условий постановки реакции (электролитов, оптимальных температур и рН среды).

Серологические реакции ставят в двух направлениях:

а) для сероидентификации – определения неизвестных антигенов с помощью известных антител (иммунной диагностической сыворотки); б) для серодиагностики – обнаружения специфических антител в исследуемой сыворотке с

помощью известных антигенов (диагностикумов).

Всерологических реакциях используются диагностические препараты. Сероидентификация антигенов (микроорганизмов в исследуемом материале или

выделенных из него на питательных средах, их токсинов, белков крови, клеток разных тканей другого вида) осуществляется с помощью иммунных диагностических сывороток. Их получают от животных, иммунизированных убитыми или ослабленными живыми микроорганизмами, анатоксинами, эритроцитами и другими антигенами.

Серодиагностика для определения специфических антител проводится с использованием диагностикумов (микробных, эритроцитарных) и мелкодисперсных антигенов.

Основными серологическими реакциями являются: реакция агглютинации, непрямой гемагглютинации, преципитации, связывания комплемента, нейтрализации, лизиса, иммунофлюоресценции, а также иммуноферментный, радиоиммунный анализы и их варианты.

Реакция агглютинации

Реакция агглютинации (agglutinacio – склеивание) – склеивание корпускулярных антигенов (микроорганизмов, эритроцитов и др. клеток) под действием специфических антител в присутствии электролита, что проявляется образованием осадка в виде хлопьев или зерен.

Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента:

1)антиген (агглютиноген),

2)антитело (агглютинин),

3)электролит (физиологический раствор хлорида натрия).

Реакция протекает в две фазы. В первой фазе происходит специфическое присоединение антител к поверхности клетки, во второй – образование агглютината и выпадение его в осадок в присутствии электролита. Видимая реакция наблюдается в том случае, если антитела имеют два активных центра, к каждому из них присоединяется антиген, и в результате образуется «решетка». Электролит способствует формированию гидрофильной оболочки вокруг клетки. За счет взаимодействия этих гидрофильных оболочек происходит склеивание клеток и выпадение их в осадок.

Рис. 1. Схема реакции агглютинации бактерий с антителами IgM и IgG *

Применяются различные варианты реакции агглютинации: прямая, непрямая (реакция Кумбса), ориентировочная (на стекле), развернутая (в пробирках или лунках планшетов), реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА), реакция торможения гемагглютинации (РТГА) и др..

РА используют:

1)для сероидентификации неизвестного микроба по известной агглютинирующей сыворотке;

2)в серодиагностике инфекционных заболеваний, т.е. для определения специфических антител в исследуемой сыворотке с помощью известного микробного диагностикума;

3)для определения группы крови и резус-фактора.

Реакция агглютинации для сероидентификации бактерий

Групповую, видовую и типовую принадлежность неизвестного микроба определяют при помощи диагностической агглютинирующей сыворотки. Для получения агглютинирующих сывороток проводят многократную (5 – 7 раз) иммунизацию лабораторных животных, чаще кроликов, убитыми или живыми, но ослабленными микроорганизмами. Антигены (взвесь

микробов) сначала вводят подкожно, а при последующих инъекциях – внутривенно в возрастающих дозах с интервалами в 3 – 5 дней. Через 7 дней после окончания иммунизации у животных берут кровь, отделяют сыворотку и титруют.

Титром агглютинирующей сыворотки называется максимальное её разведение, в котором наблюдается агглютинация гомологичного микроба.

Полученные таким образом сыворотки называются неадсорбированными, поскольку содержат групповые агглютинины и могут в небольших разведениях склеивать родственные по антигенам бактерии.

Способы постановки РА:

•РА на предметном стекле в капле сыворотки, разведенной 1:10 (ориентировочная), наступает в течение нескольких минут;

•РА развернутая в пробирках или лунках планшетов с последовательными разведениями сыворотки.

Кроме специфической агглютинации возможны спонтанная (дают R-формы бактерий) и «кислотная» неспецифические агглютинации. Чтобы их исключить всегда ставят контроль антигена (КА) с взвесью используемых в РА микробов в физиологическом растворе.

Для более точной сероидентификации неизвестного микроба ставят развернутую реакцию с сывороткой, вызвавшей агглютинацию, до её титра.

Вид микроба или его серовар определяется по сыворотке, если агглютинация наблюдается до титра диагностическом сыворотки или в разведении близком ему.

В зависимости от свойств АГ внешнее проявление положительной РА бывает различным. Мелкозернистую О-агглютинацию дают бактерии, лишенные жгутиков; она протекает медленно, в течение 18-20 часов. Крупнохлопчатая Н-агглютинация наблюдается у бактерий, имеющих жгутики. Она протекает быстрее, в течение 2-4 часов.

Более достоверные результаты при сероидентификации бактерий дают адсорбированные (монорецепторные) сыворотки, лишенные групповых агглютининов, вследствие чего нет необходимости разводить их. РА с такими сыворотками ставят на предметном стекле.

Реакция агглютинации для серодиагностики инфекционных болезней

Выявление специфических антимикробных антител широко используют в ретроспективной диагностике инфекционных заболеваний. Для этого, со второй недели заболевания, когда в организме больного появляются специфические антитела, ставят РА с исследуемой сывороткой. В реакции используют микробные(корпускулярными) диагностикумы – стандартные препараты, полученные из чистых культур инактивированных микроорганизмов, утративших патогенные свойства, но сохранивших антигенность .

Чаще используют развернутую РА, поскольку известно, что у больных могут содержаться в крови антитела, приобретенные в результате перенесенного ранее заболевания или вакцинации.

Титром сыворотки является последнее её разведение, в котором наблюдается видимая агглютинация.

Критерием заболевания служит диагностический титр, заранее отработанный для всех заболеваний, при которых используется серологический метод. Например, диагноз брюшного тифа подтверждается, если титр специфических антител в исследуемой сыворотке, равен или выше 1:200.

В сомнительных случаях критерием является нарастание титра специфических антител в течение болезни. Для этого РА ставят с сывороткой больного, взятой через 1-2 недели.

Диагностическую ценность серологических исследований может повысить определение АТ, относящихся к разным классам иммуноглобулинов (IgM и IgG). IgM образуются в более ранние периоды заболевания, поэтому могут служить показателем недавнего инфицирования. В последующем они сменяются IgG, которые выявляются при рецидивах инфекции. Возможность дифференцировать эти два класса иммуноглобулинов основана на их различной чувствительности к действию меркаптоэтанола, цистеина и других редуцирующих веществ: IgM расщепляются под действием этих веществ, IgG сохраняют свою целостность.

РА широко используют для диагностики многих инфекционных заболеваний: брюшного тифа и паратифов, сыпного тифа, бруцеллеза, туляремии, эшерихиозов, сальмонеллезов, дизентерии, холеры, чумы, коклюша и др.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА, РПГА)

Применяется при работе с растворимыми, мелкодисперсными антигенами. В реакции используются стандартные эритроцитарные диагностикумы. Их получают производственным способом путем адсорбции на эритроцитах антигенов бактерий (антигенные диагностикумы) или специфических антител (антительные диагностикумы).

Для выявления специфических антител в исследуемой сыворотке используют антигенные эритроцитарные диагностикумы. Реакцию ставят в пластмассовом планшете, в лунках которого готовят последовательные разведения сыворотки больного. В каждую лунку вносят одинаковый объем эритроцитарного диагностикума. При наличии специфических антител в исследуемой сыворотке происходит их взаимодействие с антигенами, адсорбированными на эритроцитах. В результате чего эритроциты склеиваются и выпадают в осадок с неровными краями в форме «зонтика». В отсутствие антител эритроциты образуют осадок с ровными краями в виде «пуговки».

Рис. 2. Схема реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации *

РНГА более чувствительная и специфичная, чем РА. Её широко применяют при лабораторных и научных исследованиях в двух направлениях: в серодиагностике инфекционных заболеваний (брюшного тифа, дизентерии, эшерихиозов, сыпного тифа и других риккетсиозов, бруцеллеза, туляремии, токсоплазмоза, листериоза, микоплазмоза, цитомегаловирусной инфекции) и аллергических состояний; для раннего обнаружения антигена в организме больного и объектах внешней среды при ботулизме, дифтерии, чуме, гепатите В, вирусных энцефалитах и других инфекций.

Реакция Кумбса (реакция гемагглютинации антиглобулином)

Прямую реакцию используют для обнаружения неполных антител, адсорбированных на эритроцитах, непрямую – для выявления таких же, но свободных антител. Неполные антитела, связываясь с антигеном, блокируют его, но при этом не вызывают агглютинации эритроцитов. Реакцию проявляют добавлением антиглобулиновой сыворотки, содержащей антитела к иммуноглобулинам человека, что приводит к феномену гемагглютинации.

Рис. 3. Схема реакции Кумбса

С помощью реакции Кумбса диагностируют аутоиммунные заболевания для выявления неполных антител. Её используют в серодиагностике гемолитической болезни новорожденных при резус-конфликтах, когда эритроциты резус-положительного плода соединяются с циркулирующими в крови неполными антителами к резус-фактору от резус-отрицательной матери.

Фагоцитоз – процесс активного поглощения и переваривания специализированными клетками организма (фагоцитами) микробов и других чужеродных клеток и веществ.

Явление фагоцитоза открыл И. И. Мечников (1883), который разделил фагоциты на микрофаги и макрофаги. К микрофагам относятся полиморфноядерные лейкоциты (нейтрофилы, базофилы, эозинофилы). Макрофаги – это моноциты крови и тканевые макрофаги (клетки Купфера, альвеолярные, перитониальные, эпидермиоциты и др.). В настоящее время макрофаги с их предшественниками объединены в особую систему мононуклеарных фагоцитов (СМФ).

Функции фагоцитов:

1 – защитная

Фагоциты первыми реагируют на чужеродные субстанции (микробы, продукты распада тканей и т.д.), поглощая и уничтожая их.

2 – представляющая и 3 – секреторная

Они принимают участие в формировании иммунного ответа путем презентации антигенных эпитопов на своей мембране и выработки биологически активных веществ – интерлейкинов, регуляторов иммунного ответа. Благодаря наличию рецепторов к комплементу, иммуноглобулинам и антигенам HLA, макрофаги принимают участие в связывании и распознавании антигенов.

Фагоцитоз имеет несколько стадий: хемотаксис, адгезия, эндоцитоз (поглощение микроба), внутриклеточное переваривание (слияние фагосомы с лизосомой).

Фагоцитоз, который включает в себя все четыре стадии, называется завершенным. При незавершенном фагоцитозе отсутствует последняя стадия (гонорея, лепра, туберкулез и др.).

Фагоцитоз ускоряют опсонины, комплемент, лимфокины, гистамин, соли Ca2+, Mg2+, электролиты. Угнетают фагоцитоз факторы патогенности микроорганизмов (капсульные вещества, М-протеин стрептококка и др. инфекций, токсины, агрессины), ионизирующая радиация.

Влияние ионизирующей радиации на инфекцию и иммунитет

Ионизирующая радиация обладает мощным проникающим и повреждающим клеточный геном действием. Облучение животного организма вызывает развитие специфической лучевой болезни. Иммунный статус организма в этих условиях существенно изменяется.

Естественная резистентность Резко повышается проницаемость тканей, снижается роль кожных и слизистых барьеров.

Бактерицидность кожи и слизистых снижается. Это способствует всасыванию в кровеносное русло продуктов распада тканей и собственной микрофлоры, что приводит к аутоинфекции, которая значительно отягощает течение лучевой болезни.

В облученном организме значительно ослабевает течение воспалительного процесса, а некротические явления преобладают. Угнетается фагоцитоз, снижается % его завершенности. Снижается содержание лизоцима, подавляется образование интерферона, количество пропердина и комплемента в крови.

Резистентность к заражению и бактериальным токсинам Чувствительность облученных животных к заражению микроорганизмами повышается в 3-

5 раз. Очаговые инфекции генерализуются, часты летальные исходы, снижается резистентность к условно-патогенным микробам.

Как к экзо-, так и к эндотоксинам устойчивость снижается, так как в облученном организме нарушаются процессы детоксикации.

Видовой иммунитет Видовая невосприимчивость отличается высокой стабильностью к действию

ионизирующих излучений. У облученных не развиваются несвойственные данному виду инфекции.

Приобретенный иммунитет

Чем выше доза облучения, тем выше степень угнетения выработки антител. Время иммунизации существенно влияет на степень подавления антителогенеза.

Облучение организма летальными и сублетальными дозами до иммунизации угнетает выработку антител, удлиняются сроки антителообразования, однако полной ингибиции не происходит. Максимальное угнетение наблюдается при иммунизации через 1-2 суток после облучения.

Облучение иммунизированного организма, проведенное на высоте антителообразования, может кратковременно в несколько раз уменьшить количество циркулирующих антител, но обычно через сутки число их быстро восстанавливается.

Облучение, проведенное после иммунизации, или не влияет на синтез антител, или несколько замедляет его. Значительный титр антител у облученных организмов не отражает резистентности к возбудителю, обычно она значительно снижена.