Культивирование, пересадка нервных клеток

Культивирование, пересадка нервных клеток.

Культивирование.

Проблема исследования нейронных сетей и изучения принципов их работы является одной из наиболее актуальных в нейронауке.

Нервная ткань представляет собой сеть нейронов и глиальных клеток. Нейроны формируют функциональные сети, каждая из которых ответственна за определенные задачи поведения на уровне организма.

Культивирование клеток представляет собой процесс, посредством которого клетки искусственно выращиваются в контролируемых условиях, получают клетки чаще всего от крысы или мыши.

В монослойных диссоциированных культурах мозга развивающиеся нервные клетки полностью разобщены и на первых этапах развития лишены афферентных влияний, которые возникают лишь позднее, по мере дифференцировки нейронов и формирования между ними синаптических связей.

В результате ферментной и механической обработки ткани большинство диссоциированных клеток утрачивает отростки, округляется, клеточной суспензии, помещенной мультиэлектродную матрицу, можно видеть лишь тела клеток с крупным круглым ядром и узким ободком цитоплазмы.

В первые часы после культивирования клетки округлой формы, диаметром 7,74±0,17 мкм, не имеют отростков. Только у отдельных клеток могут сохраняться их начальные сегменты. В конце первых суток культивирования большая часть жизнеспособных клеток прикрепляется к субстрату изолированно или небольшими группами (агрегатами).

Через 10-12 часов у единичных клеток появляются отростки. В первые-вторые сутки культивирования наблюдаются начальные стадии формирования отростков, которые часто имеют на концах утолщения конусы или колбы роста с тонкими подвижными пальцевидными выростами.

В течение первого дня развития in vitro увеличивается длина тел клеток. Далее рост тел нервных клеток происходит постепенно как в длину, так и в ширину. Через 2 дня развития in vitro формируется структурная сеть.

В течение первой недели культивирования растущие отростки нервных образовывают на поверхности субстрата сложные сплетения. Обычно связи между нейронами образуются хаотично, однако встречается формирование диссоциированными клетками пространственно упорядоченных нейронных сетей.

В зрелых монослойных клеточных культурах спустя 2-3 недели культивирования в основном завершаются процессы формирования дифференцированных нервных клеток, что облегчает их прижизненную идентификацию. К 15 дню развития in vitro длина клеток составляет 15.79±0.60 мкм, ширина - 12.37±0.36 мкм.

Образование волокнистых связей между нейронами диссоцированных культурах сопровождается синаптогенезом (процессом формирования синапсов между нейронами).

На 3 день развития in vitro (65-70 часов) клетки образовывают кластеры, что совпадает со временем появления спонтанной активности нейронной сети. В течение 4-5 суток эти кластеры уплотняются, сливаются в более крупные. На 6 сутки (около 150 часов) культивирования наблюдается разрастание и миграция Глиальных клеток (критические защитники НС и регуляторы) из кластеров (объединение нескольких однородных элементов, которое может рассматриваться как самостоятельная единица, обладающая определенными свойствами). В результате кластеры становятся реже или полностью распадаются.

Пересадка.

Нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера или Паркинсона, инсульты, травмы приводят к потере нервных клеток и, соответственно, функции органа, которую эти клетки выполняли. Способность мозга взрослых млекопитающих, включая человека, компенсировать эти потери очень ограничена. Поэтому ученые исследуют возможности трансплантации нервных клеток, замены утраченных нейронов новыми. До последнего времени было неизвестно, могут ли пересаженные нейроны интегрироваться в существующие нервные цепи настолько, чтобы восстановить функции пораженного участка мозга.

Немецкие исследователи решили выяснить, могут ли пересаженные эмбриональные клетки нервной ткани мыши интегрироваться в поврежденную зрительную кору взрослых мышей (о нейронах в зрительной коре известно достаточно, чтобы легко оценить, будут ли они выполнять свои функции).

Ученые хирургическим путем разрушили клетки первичной зрительной коры мышей, области мозга, где интегрируются сигналы, поступающие с сетчатки глаза. Через несколько дней в место повреждения трансплантировали эмбриональные, незрелые нейроны мыши.

В течение следующих недель за «поведением» имплантированных нейронов наблюдали с помощью метода двухфотонной микроскопии, чтобы выяснить, дифференцируются ли они в тот тип клеток, который обычно находится в данной зоне мозга – это так называемые пирамидальные нейроны. Процесс интеграции пересаженных нейронов был похож на процесс нормального развития, включая порядок морфологического созревания клеток – развития аксонов, дендритов, дендритных шипиков. В пределах двух месяцев привнесенные нейроны приобрели морфологию типичных зрелых пирамидальных клеток.

Что касается функции, то пирамидальные клетки, полученные из трансплантированных незрелых нейронов, образовали нормальные функциональные связи, могли отвечать на визуальные стимулы, обрабатывать информацию и корректно передавать ее дальше. То есть, имплантированные нейроны с высокой точностью интегрировались в нейронные сети.

Без вмешательства ученых новые нервные клетки никогда бы не появились в поврежденном участке коры. Мозг взрослого млекопитающего может регенерировать, но с помощью внесения в место повреждения незрелых нейронов.

Трансплантация астроцитов. Изолированная трансплантация астроцитов производится из-за тормозящего действия олигодендроцитов на рост (регене­рацию) аксонов. Аллотрансплантированные очищенные незрелые крысиные астроциты контактируют с кровеносными сосу­дами и подавляют образование глиальных рубцов, которые тормозят отрастание аксонов.

Трансплантация олигодендроцитов. Олигодендроциты мыши, трансплантированные в повреж­денную область белого вещества спинного мозга крыс способны ремиелинизировать поврежденные аксоны. Миелинообразующая способность (выживание, миграция и плотность миелинизации) олигодендроцитов зависит от возраста клеток и выше у олигодендроцитов, находящихся на самой ранней стадии дифференцировки. При трансплантации глиальных клеток обнаружено, что олигодендроциты и астроциты взрослых животных могут во­зобновлять миграционную активность при пересадке в мозг бо­лее молодых животных. Пересаженные олигодендроциты спо­собны устранять острые очаги демиелинизации даже у взрослых животных. Трансплантация участков спин­ного мозга 15-18-суточных эмбрионов крыс в спинной мозг крыс с мутацией, обусловливающей дефицит миелина, приводит к появлению кластеров миелинизированных волокон. Обнаружено, что, благодаря значительной пластичности попу­ляции глиальных клеток у грызунов, олигодендроциты трансплантированные от взрослых животных в мозг более молодых, восстанавливают острые очаги демиелинизации через 15-20 суток.