3 курс / Микробиология / инт06 (Общие свойства вирусов)

5.     Молекулярно-генетический.

Выбор метода определяется характером заболевания, предполагаемым возбудителем и решается в каждом случае  в зависимости от периода болезни и  возможности лаборатории.

Микроскопический метод. Вирус можно непосредственно  увидеть с помощью электронного микроскопа, но это доступно только крупным лабораториям, специализированным центрам, так как приобретение электронного микроскопа и его обслуживание требует больших материальных затрат. Недостатком является также то, что при небольшой концентрации возбудителя в изучаемом препарате его можно не увидеть. Этот недостаток отчасти устраняется применением иммунно-электронной микроскопии, которая базируется на том, что специфические антитела адсорбируются на вирионах, образуя микропреципитаты. Иммунно-электронная микроскопия дает возможность не только обнаружить вирусы, а и идентифицировать их с помощью специфической сыворотки.

Можно использовать иммерсионный микроскоп. Проводится патогистологическое исследование тканей при некоторых вирусных инфекциях. Диагноз может быть установлен при обнаружении телец Гварниери при натуральной оспе, Бабеша-Негри при бешенстве и пр. Однако подобные примеры малочисленны. Патогистологические исследования необходимо дополнять другими методами.

Исследование в световом микроскопе применяется для оценки состояния культуры клеток, зараженных вирусами.

Возможно использование люминесцентных микроскопов. При  обработке нативных и фиксированных препаратов клеток, предположительно содержащих вирусы или их нуклеиновые кислоты,  флюорохромами, например, акридин оранжевым – культуры, содержащие ДНК светятся ярко-зелёным цветом, РНК – кирпично- красным под воздействием ультрафиолетовых лучей.

Вирусологический метод. При проведении этого метода выявляют вирус в исследуемом материале (индикация) с последующей идентификацией. Является одним из наиболее достоверных доказательств в этиологической диагностике вирусных инфекций.

Важным моментом в проведении вирусологического метода является своевременный и качественный забор материала для исследования. Его необходимо брать как можно раньше, в период максимального накопления возбудителя в организме и выделения его  во внешнюю среду. Во время доставки в вирусологическую лабораторию исследуемый материал следует помещать в термос или переносной холодильник с минусовой температурой. Транспортировка должна быть проведена в сжатые сроки.  В лаборатории исследуемый материал подвергается соответствующей обработке, в том числе и антибиотиками для подавления микробной флоры.

ИНДИКАЦИЯ.

Обнаружить вирус в исследуемом материале можно по:

1.     цитопатическому действию (ЦПД);

2.      цветной пробе (ЦП);

3.      бляшкообразованию (БО);

4.      в реакции гемагглютинации (РГА);

5.      в реакции гемадсорбции (РГад);

6.      путём заражения животного;

7.      путём заражения куриного эмбриона.

Суть ЦПД.  Здоровую культуру клеток обрабатывают исследуемым материалом. Если вирус есть в материале, он оказывает цитопатическое действие на клетки, которые погибают, открепляются от стекла, меняют свою форму. Таким образом, нарушается монослой культуры клеток.

Суть ЦП. Если культура клеток развивается нормально, клетки выделяют кислые продукты и цвет среды (изначально красный) постепенно в процессе инкубации меняется в сторону желтого. Если культуру клеток обработать исследуемым  материалом, в котором будут находиться вирусы, они погубят клетки, не будут выделяться кислые продукты и цвет среды не изменится.

Суть  БО.  Монослой культуры клеток обрабатывают исследуемым материалом, покрывают тонким слоем питательной среды с 1,5% агара и красителем нейтральным красным. Через несколько дней культивирования в термостате среди прижизненно окрашенных клеток обнаруживаются бесцветные бляшки, состоящие из дегенерированных клеток. Их количество соответствует числу внесенных вирусных частиц.

Эти три теста основаны на повреждающем культуру клеток действии вирусов. Если же вирусы не повреждают клетки, тогда их обнаруживают по другим биологическим свойствам.  Используют знания других биологических свойств вирусов. Так, некоторые вирусы, а точнее их гемагглютинины связываются с рецепторами чувствительных эритроцитов, вызывая их агглютинацию. На этом основана  реакция гемагглютинации (РГА). К исследуемому материалу, налитому в лунку планшетки, прибавляют эритроциты. Если образуется гемагглютинат («зонтик») - вирус есть в материале, если гемагглютинат не образуется  («пуговка») – вируса нет.

Реакция гемадсорбции (РГад) основана на прикреплении эритроцитов  к участкам поверхности инфицированных клеток, где локализованы гемагглютинины. Культуру клеток обрабатывают исследуемым материалом, а затем прибавляют взвесь эритроцитов. Если вирус есть в клетках, на них адсорбируются эритроциты.

 Одной из распространенных моделей для вирусологических исследований являются лабораторные животные (белые мыши, крысы, кролики, сирийские хомячки и др.). Исследуемый материал вводят животному. О наличии вируса в исследуемом материале судят по клиническим проявлениям. Выбор вида животного, его возраста, пола, способа заражения определяется выделяемым вирусом.

Для обнаружения вирусов применяют и куриный эмбрион. Исследуемый материал вводят в то или иное образование куриного эмбриона (аллантоисную полость, амниотическую полость, хорион-аллантоисную оболочку и пр.) и о присутствии вирусов в материале судят по  изменениям в нём.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ. Проводится с использованием специфических антител (известных диагностических сывороток) в реакциях нейтрализации (РН). Она заключается в нейтрализации инфекционных свойств возбудителя антителами, что основано на специфическом взаимодействии антител с антигеном. Используются те тест-системы, которые брали для индикации. Идентификация осуществляется:

1.     В реакции нейтрализации цитопатического действия (РН ЦПД)

2.     В реакции нейтрализации  цветной пробы (РН ЦП)

3.     В реакции нейтрализации бляшкообразования (РН БО)

4.     В реакции торможения гемагглютинации (РТГА)

5.     В реакции торможения гемадсорбции (РТГад)

6.     В реакции нейтрализации на животном

7.     В реакции нейтрализации на курином эмбрионе

8.     В реакции связывания комплемента (РСК)

9.     В реакции преципитации

10.                       В реакции обратной пассивной гемагглютинации (РОПГА)

 

Серологический метод. Предусматривает обнаружение антител к тем или иным вирусам в сыворотке крови больных и переболевших. Часто диагноз выставляется ретроспективно. Антитела определяются в парных сыворотках. Первый раз сыворотку крови получают от больного через несколько дней заболевания и определяют в ней количество антител, разводя сыворотку физ. раствором 1:10, 1:20, 1:40, 1:80,1:160. Второй раз (у этого же больного) получают сыворотку через 1-2 недели и также определяют количество антител. Лишь четырехкратное нарастание титров антител позволяет поставить диагноз. Антитела определяют в тех же реакциях (по названию), что используют для идентификации вирусов (см. выше), а также в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), иммуноферментным анализом и др.

Экспресс-метод. Для быстрого обнаружения вируса в исследуемом материале используют реакцию иммунофлюоресценции  (РИФ), радиоиммунный анализ (РИА), иммуноферментный анализ (ИФА).

Реакция иммунофлюоресценции  (РИФ). Можно проводить в двух вариантах: прямая РИФ и непрямая РИФ. При прямой РИФ используют антитела, меченые флюорохромом (изотиоционат флюоресцеина), которые содержатся в специфической диагностической сыворотке. Таким образом, поиск определенного антигена осуществляется с помощью конкретных меченых антител – люминесцентных сывороток. При наличии возбудителя (АГ) в исследуемом материале образуется комплекс антиген+антитело с меткой, которая в ультрафиолетовых лучах дает зеленовато-желтое свечение.

При непрямой РИФ с исследуемым антигеном вначале взаимодействуют специфичные в отношении его антитела, а уже с ними (первыми антителами) взаимодействуют антивидовые антитела (антитела против иммуноглобулинов диагностической сыворотки) меченые флюорохромом. Преимущества непрямой РИФ состоят в том, что отпадает необходимость иметь большой набор разных специфических флюоресцирующих антител, так как она базируется на использовании антиглобулиновых антител. Непрямую РИФ можно использовать не только для быстрого выявления антигенов (возбудителя), но и  для обнаружения антител в сыворотке крови больных.

Радиоиммунный анализ (РИА). В основе радиоиммунного анализа лежит использование известных антител, меченых радионуклеидом, которые вступают в реакцию с искомым антигеном. Иммунные комплексы, образующиеся при этом взаимодействии, выявляют с помощью счетчиков импульсов радиоактивного распада. В РИА можно выявлять и антитела в сыворотке крови обследуемого с помощью известных антигенов меченых радионуклеидом. Широкое использование этого исследования ограничивает создание условий, обеспечивающих безопасность работы с радионуклеидами.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Включает использование коммерческих реактивов – антител или антигенов меченых ферментами (пероксидазой или щелочной фосфатазой). После образования иммунного комплекса в систему вносят субстрат, расщепляющий фермент. Расщепление субстрата вызывает окрашивание среды в желто-коричневый (с использованием пероксидазы) или в желто-зеленый (с использованием фосфатазы) цвет. Существуют многочисленные модификации базовой методики ИФА. Наибольшее распространение получил ИФА на твердой фазе. Для этого коммерческие моноклональные антитела или антигены фиксируют на поверхности лунок пластиковых планшет, в которые потом  вносят исследуемый материал, содержащий антигены или антитела.

Молекулярно-генетический метод. Основан на идентификации ДНК и РНК, специфичных для того или иного вируса и включает реакцию молекулярной гибридизации (МГ) и полимеразную цепную реакцию (ПЦР). В основе ПЦР лежит многократное увеличение числа копий специфического участка ДНК (так называемая направленная амплификация ДНК). Этот процесс катализирует фермент ДНК-полимераза. Использование термостабильной ДНК-полимеразы создает возможности  для автоматизации синтеза нуклеиновой кислоты in vitro. Реакция высокоспецифична, высокочувствительна. Высокий уровень чувствительности достигается за счет того, что в результате многократного копирования уровень специфической олигонуклеотидной  последовательности в пробе возрастает в 10⁶-10⁸ раз. С помощью этой реакции можно быстро получить конечный результат.

Реакция молекулярной гибридизации (МГ). Реакция базируется на способности двухцепочечной ДНК при повышенной температуре (90°С) в щелочной среде денатурироваться, т.е. расплетаться на две нити, а при понижении температуры на 10°С снова восстанавливать начальную двухцепочечную структуру. В реакции молекулярной гибридизации используют молекулярный зонд  (одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты с радиоактивной меткой). Зонд запускают в исследуемый материал. При комплементарности между зондом и исследуемой ДНК образуется двойная спираль, что можно выявить с помощью подсчета степени радиации.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусоспецифической последовательности ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы и 2 специфических затравок – праймеров. Каждый цикл состоит из 3 стадий  с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25-35 циклов наработать достаточное число копий выбранного участка ДНК для её определения, как правило, с помощью электрофореза в агарозном геле. Реакция высокоспецифична,  очень чувствительна и позволяет обнаружить несколько копий вирусных ДНК в исследуемом материале. В последние годы ПЦР находит всё более широкое применение для диагностики и мониторинга вирусных инфекций (вирусы гепатитов, герпеса, цитомегалии, паппиломы и др.). Разработан вариант количественной ПЦР, позволяющий определять число копий  амплифицированного сайта ДНК. Методика проведения сложна и недостаточно унифицирована для широкого применения.

Испражнения больного с подозрением на кишечную вирусную инфекцию обработали антибиотиками и заразили первичные культуры и культуры перевиваемых клеток. Через 2-3 дня в зараженных культурах клеток выявлено цитопатическое действие, присущее энтеровирусам. С помощью какой реакции необходимо дальше провести идентификацию обнаруженных цитопатогенных агентов?