3 курс / Микробиология / инт04 (Сифилис, лептоспироз, возвратный тиф)

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА СИФИЛИСА

     Возбудитель Treponema pallidum входит в семейство Spirochaetaceae, род Treponema. Материалом для исследования служит отделяемое твердого шанкра или его пунктат, пунктат лимфатического узла, соскоб с розеолы, ликвор, кровь. При заборе материала у больного необходимо соблюдать меры предосторожности (работа в резиновых перчатках).

Электронная микроскопия Treponema pallidum

     Микробиологическую диагностику сифилиса проводят микроскопическим и серологическим методами.

     Микроскопический метод. Каплю тканевой жидкости или экссудата наносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. Препарат «раздавленная капля» исследуют в темном поле. T. pallidum имеет вид нежной спирали с 8-12 завитками одинакового размера. Спирохеты подвижны, проявляют 4 вида движений: вперед, назад, вращательные и сгибательные. Эти признаки отличают ее от сапрофитных трепонем, которые могут существовать на половых органах и в полости рта.

     Микроскопируют также препараты из исследуемого материала, окрашивая их по Романовскому. Спирохеты по этому способу окрашивания приобретают бледно-розовую окраску. Хорошие результаты дает окрашивание по Бурри, серебрение по Морозову.

     Серологический метод. Является основным методом диагностики сифилиса, так как его можно использовать в разные периоды заболевания, кроме первичного серонегативного сифилиса. Для выявления специфических антител используют комплекс серологических реакций: реакцию Вассермана, реакцию микропреципитации, реакцию иммобилизации трепонем, реакцию иммунофлюоресценции. В этих реакциях используют как специфический трепонемный антиген, который готовят из разрушенного ультразвуком штамма Рейтера (апатогенного культурального штамма T. pallidum), так и неспецифический кардиолипидный антиген (экстракт из сердца быка).

     Реакция Вассермана (RW) основана на принципе реакции связывания комплемента и отличается от последней тем, что при ее постановке наряду со специфическими антигенами участвуют и неспецифические.

     RW бывает положительной через 2-3 недели после появления твердого шанкра, в течение всего вторичного периода и в 75% случаев в третичном периоде. Необходимо учитывать тот факт, что довольно часто реакция Вассермана дает лжепозитивный результат.

     В качестве скрининг-тестов применяют и реакцию микропреципитации с плазмой крови и с инактивированной сывороткой.

     Для постановки окончательного диагноза с использованием серологического метода ставят одну (или несколько) из перечисленных ниже специфических реакций:

     • реакцию иммунофлюоресценции (РИФ)

     • иммуноферментный анализ (ИФА)

     • реакцию иммобилизации бледных трепонем (РИБТ)

     • реакцию иммунного прилипания (РИП)

     • реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА)

     Реакция иммунофлюоресценции. Для РИФ, что ставится в непрямом варианте, в качестве антигена используют штамм Николса (тканевая культура бледной трепонемы от инфицированного кролика).

     Иммуноферментный анализ находит все большее применение в диагностике сифилиса. Налажен выпуск диагностических тест-систем.

     Реакция иммобилизации бледных трепонем. Основана на феномене потери подвижности бледных трепонем при воздействии на них сыворотки крови больного в присутствии комплемента. Трепонемы получают из яичка кролика, пораженного специфическим орхитом. Эта реакция имеет высокую чувствительность и остается положительной даже после выздоровления больного.

     Реакция иммунного прилипания. Сущность этой реакции состоит в том, что тканевые трепонемы штамма Николса при смешивании с сывороткой крови больного сифилисом в присутствии комплемента и эритроцитов человека прилипают к поверхности эритроцитов.

     Реакция непрямой гемагглютинации. Широко используется в диагностике сифилиса благодаря простоте постановки. Она бывает положительной через 3 недели после инфицирования и остается такой много лет после выздоровления.

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ВОЗВРАТНЫХ ТИФОВ, БОЛЕЗНИ ЛАЙМА

     Возбудителем эпидемического возвратного тифа является Borrelia recurrentis, а возбудителями эндемического возвратного тифа - Borrelia duttonii, Borrelia caucasica и др. Возбудители болезни Лайма: Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii и Borrelia afzelii. Входят в семейство Spirochaetaceae, род Borrelia.

     Материалом для исследования является кровь больного. В период ремиссии можно брать и костный мозг. Используют следующие методы микробиологической диагностики: микроскопический, серологический, биологический.

     Поскольку возбудители болезни Лайма отсутствуют в периферической крови, для диагностики этого заболевания используют только серологический метод.

     Микроскопический метод. Готовят мазок крови или препарат «толстая капля». Высушенные мазки не фиксируют, красят по Романовскому. Под микроскопом на фоне клеточных элементов крови обнаруживают сине-фиолетового цвета нитевидные спирально изогнутые боррелии, размером от 5 до 20 мкм. Эти микроорганизмы имеют 3-8 иногда до 10-12 завитков. Характерной особенностью является то, что завитки неравномерные, могут быть глубокими и мелкими.

     Возбудителя легко можно обнаружить путем микроскопии препарата «висячая капля» в темном поле. Боррелии очень подвижны: могут совершать сгибательные, вращательные, поступательные движения. Стоит помнить о том, что спирохетемия наиболее выражена в начальном периоде повышения температуры тела. Для диагностики кровь у больного забирают в период апирексии из локтевой вены (2-3 мл). Кровь центрифугируют и в осадке ищут боррелии.

     Микроскопический метод является основным в диагностике возвратных тифов.

     Серологический метод. Антитела к боррелиям определяют в реакции связывания комплемента, реакции Риккенберга-Брусина (нагрузка боррелий тромбоцитами), РИФ (непрямая), ИФА.

     Постановка и учет реакции Риккенберга-Брусина. Сыворотку крови обследуемого смешивают с цитратной плазмой здоровой морской свинки в равных объемах. К трем объемам этой смеси добавляют один объем культуры боррелий. Смесь перемешивают в центрифужной пробирке и ставят в термостат на 15 минут. Затем берут пипеткой каплю со дна пробирки, наносят ее на предметное стекло и исследуют в темном поле. При наличии в сыворотке больного специфических антител, тромбоциты морской свинки адсорбируются на поверхности тела боррелий и последние теряют подвижность.

     Биологический метод. Морской свинке вводят 1-3 мл крови больного. При наличии в ней возбудителей клещевого возвратного тифа животное болеет и в ее крови находят боррелии. Этот метод позволяет отличить эпидемический возвратный тиф от эндемического клещевого возвратного тифа. Морские свинки чувствительны к возбудителю эндемического возвратного тифа.

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ЛЕПТОСПИРОЗА

     Возбудитель Leptospira interrogans входит в семейство Spirochaetaceae, род Leptospira.

Электронная микроскопия Leptospira interrogans

     Материалом для исследования служат кровь, моча, спинномозговая жидкость, секционный материал и сыворотка крови больного (для определения титра специфических антител).

     В диагностике используют микроскопический, бактериологический, биологический, серологический методы.

     Микроскопический метод. Для выявления лептоспир готовят препарат «раздавленная капля» и микроскопируют в темном поле. Лептоспиры представляют собой тонкие спиралевидные микроорганизмы. Кроме первичных мелких завитков они имеют вторичные большие, изогнутые в виде латинской буквы S или С. Длина лептоспир до 20 мкм. Эти микроорганизмы подвижны.

     Мазки окрашивают по Романовскому, тушью по Бурри, серебрением по Морозову. При окраске по Романовскому лептоспиры приобретают бледно-розовый цвет, по Морозову - коричневый или почти черный, по Бурри - остаются бесцветными на черном фоне. В крови лептоспиры обнаруживают до 5-го дня болезни, позже - в моче, спинномозговой жидкости, паренхиматозных органах.

     Бактериологический метод. Лептоспиры культивируют на питательных средах, содержащих кроличью сыворотку. Чаще других используют жидкие питательные среды Ферворта-Вольфа, Терских.

     Исследуемый материал засевают в несколько пробирок с питательной средой и культивируют при температуре 28-30ºС.

     Особенностью культуральных свойств лептоспир является то, что размножаясь в питательной среде, они не вызывают её помутнения и растут медленно. Поэтому для определения роста лептоспир, через каждые 10 дней из пробирки берут материал, готовят препарат «раздавленная капля» и микроскопируют в темном поле. При отсутствии роста в течение 3 месяцев результат считают отрицательным.

     Для дифференциации патогенных и сапрофитных лептоспир изучают их биологические, культуральные и биохимические свойства. Выделенные лептоспиры идентифицируют по серогрупповой принадлежности в реакции агглютинации с помощью набора агглютинирующих сывороток.

     Биологический метод. Исследуемый материал вводят внутрибрюшинно морским свинкам или золотистым хомячкам. Золотистых хомячков можно заражать также подкожно, внутривенно, через скарифицированную кожу и слизистые. Через 48-72 часа проводят микроскопию перитонеального экссудата и крови. Продолжают наблюдение за животными. Погибших животных вскрывают и проводят дальнейшие исследования. Лептоспиры обнаруживают в печени, почках, легких, надпочечниках.

     Серологический метод. Антитела в сыворотке крови больного обнаруживают начиная со второй недели заболевания. Для этого используют реакцию микроагглютинации, которую ставят в ряду пробирок с разведением сыворотки больного от 1:10 до 1:1000 и живой культурой лептоспир. При положительном результате можно увидеть в темном поле микроскопа образование агглютината в виде паучков (клубки из лептоспир). Специфической считают реакцию при титре не ниже 1:400 или при возникновении «зернистого» распада лептоспир. Реакцию необходимо ставить повторно для выявления нарастания титра антител.