Микробиологическая диагностика столбняка
Возбудитель Clostridium tetani входит в семейство Bacillaceae, род Сlostridium.
Материалом для исследования служит отделяемое раны, кусочки ткани, выделения из влагалища и матки (при наличии столбняка после родов или аборта), выделения из пупочного канатика (при наличии столбняка новорожденных), экссудат, перевязочный и шовный хирургический материал, образцы почвы, воздуха, пыли. В некоторых случаях исследуют слизь из носа, глотки, бронхов, налет с миндалин.
Микробиологическую диагностику столбняка проводят с целью подтверждения клинического диагноза болезни, хотя к этому прибегают нечасто в связи с типичностью клинической картины заболевания.
Чаще всего выявление возбудителя столбняка и его спор проводят для проверки стерильности перевязочного материала, препаратов для парентерального введения, а также для определения распространения спор возбудителя в объектах окружающей среды.
Микробиологическую диагностику столбняка проводят микроскопическим, бактериологическим, биологическим методами.
Микроскопический метод. Из исследуемого материала готовят мазок и окрашивают по Граму. Плотный материал растирают в ступке со стерильным кварцевым песком и физиологическим раствором, делают мазок по общепринятой методике.
Во время микроскопии окрашенного по Граму препарата обнаруживают грамположительные большие прямые палочки с закругленными концами, располагающиеся одиночно, небольшими группами или в виде коротких цепочек. Наличие типичных бацилл в виде барабанных палочек с терминальными круглыми спорами, превышающими толщину бактерии, является показателем к проведению бактериологического метода.
Применяют также фазово-контрастную и люминесцентную микроскопию. Для РИФ мазки на предметных стеклах обрабатывают противостолбнячной флуоресцентной сывороткой и микроскопируют с помощью люминесцентного микроскопа.
Бактериологический метод. Классическим методом выявления возбудителя столбняка и его токсина является выделение чистой культуры C. tetani с последующим подтверждением специфичности токсина. Исследуемый материал, полученный от больного или с трупа, после растирания фильтруют через бумажный фильтр и производят посев в пробирки со средой Китта-Тароцци. Для уничтожения посторонней неспороносной микрофлоры часть исследуемого материала после посева прогревают на водяной бане при температуре 85°С в течение 20 минут.
Посевы культивируют в анаэробных условиях при температуре 37°С в течение 2 суток в термостате. При наличии клостридий среда Китта-Тароцци становится мутной, образуется газ и появляется своеобразный запах «выгребной ямы».
Из проросшей питательной среды готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Наличие типичных микробов позволяет сделать посев на чашки с кровяным агаром и в столбик агара в пробирках. Поверхность кровяного агара в одной из чашек смачивают антитоксической сывороткой без консерванта. Посевы помещают в термостат при температуре 37°С и инкубируют в вакууме в течение суток. На кровяном агаре без антитоксической сыворотки вырастают прозрачные колонии в виде капелек росы с зоной гемолиза. На кровяном агаре с антитоксической сывороткой гемолиз не наблюдается (нейтрализация антитоксином).
В глубине столбика агара колонии столбнячных клостридий имеют вид нежных комочков ваты. Из выросших колоний готовят мазок, окрашивают его по Граму и микроскопируют.
Проросший бульон среды Китта-Тароцци исследуют на наличие столбнячного токсина с помощью биологической пробы в реакции нейтрализации. С этой целью фильтрат исследуемой культуры делят на две части. Одна из них, являющаяся фильтратом выделенной культуры микробов, составляет контроль, а другую смешивают с антитоксической противостолбнячной сывороткой и оставляют на 1 час при комнатной температуре (опыт). Белых мышей заражают контрольным и опытным фильтратом полученной культуры. За животными наблюдают 1-2 суток. Контрольные мыши погибают, а опытные остаются живыми.
Наличие столбнячного токсина можно обнаружить с помощью реакции обратной пассивной гемагглютинации с использованием эритроцитарного антительного диагностикума.
Метод Файлдса. Выделение чистой культуры C. tetani методом Файлдса проводится путем прогревания 3-4 суточного роста культуры в среде накопления в течение 1,5 часов при 60°С с последующим посевом нескольких капель среды в конденсационную воду свернутой сыворотки. Посевы помещают в строго анаэробные условия. Через 1-2 суток должен появиться «ползучий рост», подобный росту P. vulgaris при посеве по Шукевичу. С верхней части посева берут культуру и снова пересевают петлей в конденсационную воду свернутой сыворотки. Такие пересевы повторяют до получения чистой культуры.
Биологический метод. Исследуемый материал эмульгируют в физиологическом растворе, фильтруют и вводят белым мышам по 0,5 мл под кожу или в мышцу у корня хвоста (опытная группа). Контрольным животным вводят фильтрат, смешанный с антитоксической сывороткой.
При наличии в материале столбнячных палочек или их токсина у зараженных мышей в течение 1-2 суток появляются характерные признаки - несгибаемый хвост («хвост трубой»), взъерошенная шерсть, а затем типичные спазмы, начинающиеся с мышц в месте введения материала и далее переходящие на все мышцы. При этой характерной картине животные погибают. Контрольные животные остаются живыми.