3 курс / Микробиология / инт01 (Стафило-и стрептококки)
.docxМикробиологическая диагностика стафилококковых инфекций
Различают 3 вида стафилококков. Основной ущерб организму человека наносят Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus. Эти микроорганизмы входят в семейство Micrococcaceae, род Staphylococcus.
Материалом для исследований служит: гной, кровь, отделяемое слизистой оболочки, спинномозговая жидкость, мокрота, моча, а при пищевых отравлениях - рвотные массы, промывные воды желудка.
Отбор патологического материала обычно выполняют стерильными квачами, которые вносят в пробирку с транспортной питательной средой для контроля стерильности (СКС). Из закрытых гнойных очагов материал берут с помощью шприца. Мокроту, мочу, рвотные массы и промывные воды желудка помещают в стерильные пробирки, банки. Кровь засевают непосредственно у постели больного в питательную среду на основе СКС в соотношении 1:10.
Используют микроскопический и бактериологический методы.
Микроскопический метод. Из исследуемого материала (исключая кровь) готовят мазки, окрашивают по Граму. Стафилококки имеют шаровидную форму, диаметром 0,5-1,5 мкм, грамположительные. Располагаются в мазках чаще всего в виде скоплений, напоминающих гроздья винограда. Также они могут располагаться в одиночку, парами, короткими цепочками.
Микроскопическое исследование не позволяет идентифицировать стафилококки, но дает возможность сориентироваться в выборе питательных сред для выделения чистой культуры бактерий.
Бактериологический метод. Включает выделение чистой культуры микробов из исследуемого материала и их идентификацию.
Патологический материал высевают на кровяной агар, желточно-солевой агар и инкубируют в термостате в течение 18-24 часов при температуре 37ºС.
Через сутки изучают колонии, выросшие на питательной среде. Стафилококки образуют выпуклые непрозрачные колонии средней величины (1-3 мм), гомогенной структуры, гладкие с ровными краями.
Колонии S. aureus на кровяном агаре окружены зоной гемолиза и часто имеют золотистый пигмент. На желточно-солевом агаре (ЖСА) колонии этого вида стафилококков окружены радужным венчиком помутнения среды, поскольку эти микроорганизмы способны продуцировать лецитиназу.
Из изолированной колонии готовят мазок, окрашивают по Граму, микроскопируют. Оставшуюся часть колонии пересевают на скошенный мясопептонный агар и ставят его в термостат для увеличения количества выделенных микробов. Через 18-24 часов из микробного налета, образовавшегося на скошенном агаре, готовят мазок, окрашивают по Граму, микроскопируют. Убедившись, что культура выделенных микробов чистая, приступают к изучению комплекса их биологических свойств с целью видовой идентификации стафилококков.
Для дифференцировки S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus ставят реакцию плазмокоагуляции, определяют ДНК-азную активность, фосфатазу, способность расщеплять маннит в анаэробных условиях, вызывать некроз кожи кролика.
Реакция плазмокоагуляции. В пробирку наливают 0,5 мл разведенной 1:5 кроличьей плазмы и петлей вносят в нее суточную агаровую культуру стафилококка. Пробирку помещают в термостат. Появление желеобразного сгустка свидетельствует о наличии у изучаемого штамма фермента плазмокоагулазы. Это характерно для S. aureus.
Определение ДНК-азы. На поверхность мясопептонного агара, содержащего ДНК, высевают штрихом суточную агаровую культуру стафилококка и помещают в термостат на 24 часа. После инкубации поверхность агара заливают 1 N раствором соляной кислоты. Если стафилококки продуцируют ДНК-азу, то вокруг колоний остается зона просветления.
Определение фосфатазы. На чашку с фенолфталеиновым агаром высевают выделенную культуру стафилококка. Колонии, выросшие через 18-24 часов, обрабатывают парами аммиака. Появление розовой окраски колоний свидетельствует о положительной реакции.
Токсигенность выделенных культур стафилококков определяют в опыте in vitro с помощью реакции диффузной преципитации в геле.
Для установления источника инфекции определяют фаговар патогенных стафилококков.
Колонии стафилококков на кровяном агаре не выделяют пигментов и не образуют зон гемолиза?
Нет
Микробиологическая диагностика стрептококковых заболеваний
Наиболее частыми возбудителями стрептококковых заболеваний являются: S.pyogenes, S. agalactiae, S. bovis, стрептококки группы C и G, которые входят в семейство Streptococcaceae, род Streptococcus.
Материалом для исследования служит гной, отделяемое из зева и носа, ликвор, мокрота, кровь, моча, содержимое везикул, пустул.
Материал отбирают одноразовым шприцем или стерильным ватным тампоном, который помещают в пробирку с транспортной питательной средой (СКС- среда для контроля стерильности).
Кровь для бактериологического исследования в объеме 5-10 мл засевают в сахарный бульон непосредственно у постели больного таким образом, чтобы соотношение крови и питательной среды было не менее 1:10 - 1:20. Срок передачи патологического материала в бактериологическую лабораторию не должен превышать двух часов.
Микробиологическую диагностику стрептококковых заболеваний проводят микроскопическим, бактериологическим и серологическим методами.
Микроскопический метод. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают его по Граму. При микроскопии в мазке обнаруживаются грамположительные кокки, которые располагаются короткими цепочками, иногда попарно или в виде единичных кокков. На основании изучения только морфологических и тинкториальных свойств невозможно определить род выявленных в препарате микробов.
Для выявления патогенного стрептококка в материале от больного используют реакцию имунофлюоресценции (РИФ). В этом случае используют специфические сыворотки, в которых антитела против стрептококков мечены флюорохромом (см. приложение).
Бактериологический метод является основным в диагностике стрептококковых заболеваний. Взятый для исследования материал засевают в среду обогащения, в качестве которой используют среду для контроля стерильности (СКС). После инкубации в термостате исследуемый материал высевают в сахарный бульон и на 5% кровяной агар с целью выделения чистой культуры микробов, изучения культуральных свойств и характера гемолиза. Посевы помещают в эксикатор с плотно прилягающей крышкой и зажженной внутри свечой, или в анаэростат, где создают повышенную концентрацию двуокиси углерода. Инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 18-24 часов. В сахарном бульоне S. pyogenes дает придонно - пристеночный рост с образованием мелкозернистого осадка и сохранением полной прозрачности среды. S. bovis вызывает интенсивное помутнение бульона с образованием небольшого гомогенного осадка. В изготовленных из бульонной культуры мазках стрептококки располагаются обычно в виде типичных для них длинных цепочек.
На кровяном агаре стрептококки образуют мелкие (1-2 мм в диаметре) прозрачные или полупрозрачные колонии серовато-белого цвета. По типу гемолиза на кровяном агаре стрептококки разделяют на три группы.
Первая группа представлена β-гемолитическими стрептококками, способными вызывать полный лизис эритроцитов (полное просветление среды) вокруг колоний. Колонии прозрачные, слизистые, круглой формы, напоминают капли росы. Это характерно для свежевыделенных штаммов S. pyogenes. Блестящие колонии характерны для многих штаммов S.agalactiae.
Вторая группа представлена α-гемолитическими стрептококками, которые вызывают на кровяном агаре неполный гемолиз в виде полупрозрачной зоны зеленоватого оттенка. Зеленящие стрептококки растут в виде мелких колоний серого цвета с гладкой или шероховатой поверхностью. Такой рост характерен для многих видов стрептококков, вегетирующих на слизистой оболочке полости рта (S.salivarius, S.mutans, S.oralis и др.)
Третья группа представлена негемолитическими γ-стрептококками. Они не вызывают изменений кровяного агара в процессе своего роста и имеют слабо выраженную вирулентность.
Из подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Колонии, выросшие на кровяном агаре, пересевают на скошенный кровяной агар. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 18-24 часов. С целью проверки чистоты выделенной культуры, из микробного налета, выросшего на скошенном агаре готовят мазок, окрашивают по Граму, микроскопируют. Если культура микробов чистая продолжают изучать её биохимические и антигенные свойства. Для установления видовой принадлежности стрептококков наибольшее значение имеют следующие тесты: тип гемолиза на кровяном агаре, проба на каталазу, чувствительность к бацитрацину и сульфаниламидам (сульфаметоксазола и триметоприма), желчно-эскулиновый тест, рост в бульоне с 6,5% NaCl, наличие пиролидонилариламидазы (PYR), гидролиз гипурата натрия.
Проба на каталазу. Тест основан на способности микроорганизмов, которые имеют этот фермент, расщеплять перекись водорода с образованием кислорода и воды. Для постановки этого теста чистую культуру помещают в каплю 3-10% раствора перекиси водорода на предметном стекле и растирают круговыми движениями. В положительном случае наблюдают выделение пузырьков газа. В отличие от стафилококков, стрептококки не имеют этого фермента.
Проба с бацитрацином и сульфаниламидами. Для предварительной идентификации S.pyogenes и β-гемолитических стрептококков групп C и G используют два бумажных диска, один из которых пропитан раствором антибиотика бацитрацина, а второй - смесью сульфаметоксазола и триметоприма. Диски помещают на чашку с кровяным агаром, засеянную исследуемой культурой и инкубируют 18-24 часов в аэробных условиях. Любая видимая зона задержки роста вокруг дисков интерпретируется как чувствительность к этим антимикробным препаратам. Абсолютное большинство штаммов S. pyogenes чувствительны к бацитрацину, а стрептококки групп С и G - к сульфаниламидам.
Желчно-эскулиновый тест. Используется для предварительной идентификации стрептококков S.bovis, которые растут на желчно-эскулиновом агаре с образованием колоний темно-коричневого или черного цвета.
Рост в бульоне с 6,5% раствором NaCl. S.agalactiae в отличие от других стрептококков устойчив к высокой концентрации хлористого натрия и дает рост в бульоне через 24-48 часов инкубации в термостате при температуре 37°С.
PYR - тест. В основе теста лежит выявление фермента пиролидониламидазы, которая есть у большинства штаммов S. pyogenes и не встречается у других стрептококков. Исследуемую культуру вносят петлей в питательный бульон, содержащий 0,01% L-пиролидонил-β-нафтиламид и инкубируют при температуре 37°С в течение 4 часов. После добавления одной капли диметиламиноациннамальдегида в положительном случае появляется ярко-красная окраска.
Гидролиз гипурата натрия. В основе данного теста лежит способность S. agalactiae вызывать гидролиз гипурата натрия. Выделенную чистую культуру с помощью петли диспергируют в 1% водном растворе гипурата натрия. Через 2 часа инкубации при температуре 37°С добавляют 3,5% раствор нингидрина в смеси бутанола и ацетона (1: 1). При положительном результате после инкубации в течение 10 мин. появляется пурпурное окрашивание.
Дифференцирование стрептококков по антигенной структуре. Основывается на выявлении полисахаридного антигена клеточной стенки стрептококка. Применяют реакцию преципитации с группоспецифическими сыворотками групп А, В, С, G. Эти сыворотки наливают в 4 узкие преципитационные пробирки. Экстракт, полученный после обработки центрифугата чистой культуры стрептококка раствором хлористоводородной кислоты, осторожно, не смешивая жидкости, наслаивают на группоспецифические сыворотки. При положительной реакции на границе двух жидкостей появляется белое кольцо. Реакция преципитации проявляется через 5-30 мин.
Серологический метод диагностики стрептококковых заболеваний нашел применение в случае установления диагноза ревматизма. Для этого в сыворотке крови больного определяют титр антител к экстрацеллюлярным продуктам стрептококка - стрептолизину-О. Исследуют парные сыворотки больного с интервалом 7-10 дней. Препарат стрептолизин-О, который выпускают в сухом виде, растворяют и вносят в каждую пробирку с разведенной сывороткой. В день постановки опыта готовят 5% взвесь эритроцитов дефибринированной крови кролика и также вносят в каждую пробирку.
Реакция основана на нейтрализации способности стрептолизина-О лизировать эритроциты in vitro в случае присутствия в сыворотке больного антител против стрептококка (антистрептолизина-О). Максимальное разведение сыворотки, обеспечивающее задержку гемолиза эритроцитов, указывает на соответствующее количество антистрептолизина-О.
Титр антистрептолизина-О у практически здоровых лиц не превышает 250 международных единиц. При острых и хронических стрептококковых инфекциях он нарастает, причем при наличии ревматизма или нефрита с первых дней заболевания отмечается очень высокий титр антител (500 ед. и выше).